1 “困難序列”形成的主要原因

根據形成原因的不同，多肽“困難序列”可以分為隨機和非隨機兩種類型［5］，隨機型“困難序列”與氨基酸疏水性及立體位阻有關。當氨基酸的

立體位阻較大（如氨基酸的側鏈具有較大保護基）時，酰化試劑擴散困難；或樹脂的負載量較大時，樹脂上的肽鏈溶劑化不*，偶聯結果都很差

［5］。隨機困難肽可以通過疏水性參數來粗略表示［6］，現在仍沒有一條“黃金規則”能準確預測。一般認為，當疏水性參數達到正數，其合成

就相當困難［7］。非隨機型“困難序列”是指易形成具有穩定且特異性 β-折疊結構的肽鏈序列。該類序列的肽鏈在一定長度時很容易發生氫鍵締

合，且與樹脂載體之間也容易出現分子聚集現象，多肽分子的氨基可能埋沒在二級結構的深處，進而阻止縮合反應，此現象常出現在難溶多肽的合

成中［4，8］。使用 9-芴甲氧羰基（Fmoc）保護的氨基酸合成多肽時容易形成這種 β-折疊結構，合成過程需要改變反應條件如提高溫度等破壞這

種構型，但這可能會導致產物消旋化或提前脫除Fmoc保護等不良反應［7］。 2 解決“困難序列”多肽合成困難的方法解決“困難序列”多肽合成

困難的方法有很多，可以從改變反應體系、改變反應條件、改變合成策略、采用新的合成技術手段等方面進行。 2. 1 改變反應體系2. 1. 1 使用

混合溶劑 多肽樹脂在溶劑中達到充分溶脹狀態時，有利于縮合反應的進行。當選用如N- 甲 基 吡 咯 烷 酮（NMP）、N，N- 二 甲 基 甲 酰 胺（

DMF）、二 甲 亞 砜（DMSO）、N，N-二 甲 基 乙 酰 胺（DMAc）等受氫溶劑時，其羰基（C=O）與肽鏈上的N-H 可以形成氫鍵，從而抑制了肽鏈自

身形成氫鍵而造成的聚集，進而抑制 β-折疊的生成。因此，選用 合 適 的 混 合 溶 劑 ，比 如 DMSO/DMF、6N 胍 啶/DMF、異丙醇/DMF、二氯

甲烷（DCM）/DMF/NMP、三氟乙醇（TFE）等有助于縮合反應的進行。黃惟德在《多肽合成》一書中提到，DMF為溶劑的反應液中加入 20％體積的三

氟乙醇（TFE）可幫助接肽速率提高［9］。朱亮亮等在大位阻氨基酸Fmoc-Arg（Pbf）-OH與Rink Amide-AM樹脂的高效縮合中以DMAc/DCM為反應溶劑

，連接率高達93％［10］。 2. 1. 2 使用溶脹性能更好的樹脂 當樹脂的負載量較大時，樹脂上的肽鏈溶劑化不*，偶聯結果很差［5］。使用溶

脹性較好的樹脂，同時減少樹脂擔載量，有利于“困難序列”多肽的合成。比如Winkler等 在 合 成“ 困 難 序 列 ”多 肽 K5（ 序 列 ：

CGGKVSALKEKVSALKEKVSALKEKVSALKEKVSALKE）時，采用 PEG-PS 樹脂代替常規的 PS/DVB 樹 脂，使得粗肽收率有了顯著性提高［11］。然而，由于

成本高昂，這種方法不適合于大規模的工業生產［12-13］。 2. 1. 3 選用高效縮合試劑 選用高效縮合試劑，可以有效地促進縮合反應的順利進行

，也是解決“困難序列”多肽合成困難的一種常見方案，見圖1。通常DIC的反應活性低于HBTU，HBTU的反應活性低于TBTU、PyBOP和HATU［14-15］

。所以，在反應活性比較低的時候，可以選擇高活性的縮合試劑。

2. 2 改變反應條件

2. 2. 1 提高反應溫度 提高反應溫度有助于降低鏈聚合現象。BACSA B等［16］在合成1個九肽的實驗中發現將合成溫度提高到 60 ℃左右，最終產

品的純度可達到 83%。然而，提高反應溫度會導致新的不良反應的發生，比如側鏈保護基的斷裂［17］。所 以，在盡可能減少不良反應的情況下，

可以提高反應的溫度。 2. 2. 2 調節反應 pH 值 調節反應 pH 值能改變多肽在溶劑中的溶解度，從而提高“困難序列”多肽的合成效率。比如 

QIN X 等［18］、AJIKUMAR P K 等［19］研究了體系的 pH 值對多肽收率的影響，發現根據多肽序列中酸性和堿性氨基酸的數量，適當調節溶劑的 

pH值，可以提高肽鏈的溶解性，促進反應的進行。然而，由于在該 pH值條件下，多肽保護基可能不穩定，所以不常使用［20］。 2. 2. 3 使用高

離液鹽 高離液鹽能破壞肽鏈間的氫鍵，從而破壞 β-折疊結構，提高“困難序列”多肽的合成效率。常見的高離液鹽有尿素、LiCl、NaClO4 等。

比如，WESTALL F C等［21］在合成“困難序列”多肽時，發現加入尿素之后可使 Asn 及 Glu 的縮合率由70％提高至。這可能是由于尿素具

有受氫能力，干擾了肽鏈上的氫鍵締合，從而促進了多肽的合成。然而，使用高離液鹽會降低反應液的濃度，對反應速率有一定影響。2. 3 改變合

成策略

2. 3. 1 片斷合成法 常規多肽固相合成，是從碳端開始按照氨基酸的順序依次合成。當遇到“困難序列”時，采用片段合成法先制備帶有保護基的

中間序列片段，再經過進一步活化、縮合得到保護的多肽，最后脫去保護基得到目標多肽。片段合成要考慮多肽片段的長短、連接位點和固相載體

這 3 個關鍵因素。由于肽段羧基端氨基酸比氨基端氨基酸更容易發生消旋反應，因此首先選擇多肽片段 C末端的氨基酸。適合做C末端的氨基酸有

Gly（甘氨酸）、Pro（脯氨酸）、Glu（谷氨酸）、Leu（亮氨酸）和Asn（天冬酰胺）等［22］。周建華等［23］以王樹脂為固相載體制得 25-34 

肽樹脂；以 2-氯三苯甲基氯樹脂為固相載體制得 1-11、12-16 和 17-24 等 3 個片段的全保護肽；然后將 3 個片段的全保護肽按照肽序依次縮合

到 25-34 的肽樹脂上，經三切割并脫除側鏈保護基得特立帕肽粗品。SHI L等［24］采用片段合成法順利地合成了阮病毒蛋白片段。張穎等

［25］在合成含有 3 股 β 折疊的齊考諾肽（25 肽，序列：CKGKG AKCSR LMYDC CTGSC RSGKC-NH2）的過程中，采用固相合成得到4個片段，分別

是［19-25］A、 ［12-18］B、［6-11］C 和［1-5］D，再將 B、C、D 依次偶聯到肽樹脂A上，最后從樹脂上裂解得到線形粗肽。該方法相對于傳統

的逐步縮合方法，縮短了合成周期，提高了粗肽的收率和純度，為長肽的合成難題提供了可行性的解決方案。 2. 3. 2 引入化學修飾的肽鏈 引入

化學修飾的肽鏈，將“困難序列”多肽的高級結構暫時性破壞，促進肽的溶解，從而有利于多肽的合成。比如，當肽鏈中含有脯氨酸片段時，縮合

形成的酰胺鍵沒有可以形成氫鍵的質子，脯氨酸的 α 碳原子處在五元環的剛性結構中，從而抑制了 β-折疊結構的形成，所 以，在合成“困難序

列”時可以考慮引入脯氨酸來減少合成的難度。WHITE P 等［26］在合成一些較長多肽序列（95肽）的時候引入偽脯氨酸二肽結構（類似脯氨酸結

構）保護氨基酸來改善聚集問題，見圖 2。Ser、Thr和Cys 3個氨基酸可以和序列中鄰近的氨基酸形成一個偽脯氨酸二肽（fPro），肽鏈在樹脂上組

裝完成后，放在 TFA 溶液中攪拌，將多肽從樹脂上裂解下來，同時恢復正常的序列，不會影響多肽的性質［27-28］。經典的“困難序列”多肽合

成策略

3. 1 胸腺法新的合成 胸腺法新（胸腺肽 α1）的 序 列 為 Ac-SDAAV-DTSSE-ITTKD-LKEKK-EVVEEAEN-OH，是一個 28 肽。主要用來治療慢性乙型

肝炎，具有良好的免疫調節作用［36］。胸腺法新的酸性殘留位置、疏水性氨基酸的連續存在（Thr-Thr、Val-Val）

和需要大量的保護基（20 個側鏈保護基）等造成了其固相合成的困難。采用Fmoc策略合成時，C端第1 個氨基酸會用到 Fmoc-Asn（Trt）-OH，立體

位阻很大。連續疏水性纈氨酸（Val-Val）的出現，會造成β-折疊的生成；已有大量的實驗證明，偶聯至第9個氨基酸（K）時，多肽的純度會急劇

下降，胸腺法新是一個典型的“困難序列”多肽（圖4）。自胸腺法新被發現以來，多位研究者采用不同

的策略致力于該“困難序列”的合成。來自于1980 年美國羅氏公司和美國洛克菲勒大學的研究者，他們對主鏈氨基采用Boc保護的固相合成法

，總收率不到 7%［37］，后經 WANG T W 等的改進（采用羥甲基-甲基樹脂，增強了肽-樹脂鍵的穩定性），純化收率提高到 34%。然而，

采用 Boc 保護基的固相合成法，要頻繁用到 TFA 和 HF 等腐蝕性氣體，污染大，肽樹脂不穩定，如今已很少被采用。

為了提高胸腺法新的產率，1985年羅氏公司的FELIX A M 等［39］

嘗試了片段合成法，然而，最后 4

步的收率僅為 30%。1988 年德國圖賓根大學的ECHNER H等［40］

報道了用高效偶聯試劑Bop做活化劑，氨基采用 Fmoc 保護，側鏈采用 t-Bu 或 Boc 保護

的固相合成法，粗品收率達到 76%。但經過純化后，純品收率比較低。

在這些解決方案中，最成功的莫過于劉標等，他們以 HBTU/HOBt/DIPEA 體系作為縮合試劑，在易形α螺旋和β轉角的肽序位置，通過采用HOBt/DIC

補投的方法促使偶聯反應*。以茚三酮顯色的  法 對 反 應 進 行 監 控 ，獲 得 的 粗 肽 純 度 為67. 2%。以反相液相色譜法為主要分離手

段，通過多步離實現純化。胸腺法新產品純度達 99. 5%以上，總收率為 17. 2%［41］。另一個成功的解決方案是209年西班牙生物醫學研究所和瑞

士Lonza公司合作提出的，他們采用改進的Fmoc/t-Bu的固相合成法，端的 Asp主鏈羧基用 t-Bu保護，側鏈羧基連接到 PEG 氨基樹脂上，即采用 

Fmoc-Asp-OtBu 作為進入的保護氨基酸。該方法的粗品純度達到90%［42］。 3. 2 扶素康的合成 扶素康是根據 HIV 膜蛋白gp4的結構設計的

新一代膜融合抑制劑，是一個36肽 ，其 序 列 為 ：SWETW-EKEIE-NYTKQ-IYKILEESQE-QQDKN-EKDLL-E［4］。然而，由于肽鏈中含有大量的疏水性

氨基酸（W、T、I、L）和立體位阻很大的氨基酸（W、Q、N），以及需要大量的保護基（30 個側鏈保護基）等造成了其固相合成的困難。扶素康的

早期合成采用固相逐步化學合成法。采用 Fmoc保護策略、王樹脂為固相載體、反應溶劑為 DMF、HBTU/HOBt/DIPEA 為縮合劑，保護氨基酸 2倍過量

進行縮合反應、TFA/苯酚/EDT/水為切割條件，得到的粗肽純度和收率都很低［44］。為了提高扶素康的產率，郭一瓊等［44］采用片段合成的策略

。他們以 2-氯三苯甲基樹脂和王樹脂為固相載體，HBTU/HOBt/DIPEA 為縮合劑，DMF 為反應溶劑，用 HOAc（乙酸）/TFE/DCM 將全保護多肽片段由

樹脂上切割下來。將全保護多肽片段依次偶聯，再用 TFA溶液除去保護基。該條件下合成的扶素康粗品收率達 67. 31%，按標準曲線定量分析粗品

純度為38. 75%［44］。

分享來源：贛 南 醫 學 院 學 報

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