材料加工實驗方案：


1. 培養孔包被程序： 使用這些建議作為指導來確定適合您的培養系統的最佳包被條件。

  1. 從瓶子中取出所需數量的絲溶液并分配到稀釋容器中。

  2. 用水稀釋絲溶液至 1 mg/mL (1:50)。

  3. 輕輕旋轉內容物，直到材料*混合。

  4. 在培養表面加入適量的稀釋絲溶液，確保整個表面都被涂層。

  5. 在無蓋的室溫下在干凈的工作臺 (ISO 100) 中孵育 2-3 小時以*干燥。

  6. 孵化后應用 70% 甲醇 20 分鐘以誘導不溶于水的絲綢表面。

  7. 用無菌培養基或 PBS 仔細沖洗涂層表面。不要刮傷表面。

  8. 涂層表面可供使用或可在 4°C 下儲存以備將來使用。

2. 濃縮絲溶液： 如果需要更高的絲濃度，則使用此技術。更高的絲濃度對于特定的加工技術或修改最終材料特性可能很重要。

  1. 準備 10% (W/V)。聚乙二醇 (PEG, 10K MW) 與去離子水的溶液。與磁性攪拌板上的大攪拌棒混合，直到 PEG *溶解。

  2. 獲得分子量截止在 3,500 和 10,000 Da 之間的透析膜。如有必要，按照制造商的要求對透析盒進行水合。

  3. 根據透析膜制造商的填充量指南，用適量的 5% 絲溶液填充透析膜。

  4. 將填充絲溶液的透析膜放入 10%（重量/體積）PEG 溶液中并蓋上。

  5. 指明盒式磁帶添加到溶液中的時間和日期。典型的濃縮時間將根據所需的絲溶液最終濃度、被濃縮的絲溶液的體積和使用的透析膜而變化。
    注意 作為典型示例，10 mL 的 5% 蠶絲溶液在 10% (W/V) PEG 透析 20-22 小時后將產生 2-4 mL 濃縮蠶絲溶液。通常，通常根據用戶要求推薦優化運行。

  6. 濃縮時間結束后，從 PEG 浴和透析盒中取出濃縮的絲溶液，并將絲溶液儲存在 4°C 以備將來使用。注意：絲綢溶液的保質期隨著濃度的增加而縮短，因此在生產后 1 周內盡快使用濃縮的絲綢溶液。

  7. 蠶絲溶液濃度可以通過重量百分比濃度來確定。為此，請在精密天平上稱出大約 100 μL 的濃縮絲溶液并記錄濕重。讓溶液干燥成薄膜并測量絲蛋白干重。將干重除以濕重并乘以 100% 得到溶液的重量百分比濃度。

3. 獨立式絲膜： 這種加工方法生產的獨立式絲膜材料可用于細胞培養或體內移植。獨立式絲膜具有易于從培養條件中移除以進行進一步樣品分析的優勢。

  1. 將 7 mL 的 5% 絲溶液添加到 100 mm 培養皿中，并允許在干凈的工作臺環境中裸露干燥。這通常需要幾個小時，最好過夜。

  2. 形成的薄膜厚度約為 40-60 µm，可以使用鑷子從培養皿中取出。增加蠶絲溶液的量或使用更高濃度的蠶絲溶液會產生更厚的薄膜。

  3. 這些薄膜目前是水溶性的，可以使用以下任一方法使其不溶于細胞培養：

一世。甲醇浴培養：
a．用 70% 甲醇和 30% 去離子水填充盤子并混合。
灣。將絲膜放入甲醇溶液中 10 分鐘。
C。去除絲膜并用無菌水或適當的介質沖洗。
    注意： 這種處理方法可以快速產生不溶性絲膜材料特性，這些特性往往是不透明的、更疏水的，并且原位降解速度慢。

ii. 水退火：
a．獲得一個清空的實驗室真空干燥器，并在底部部分填充水。
灣。將薄膜放在水面上方的架子上，蓋上蓋子，然后拉 25 in Hg 真空。
C。停止公雞室，并允許坐 4 小時。
d。從腔室中取出樣品并用 70% 乙醇消毒，然后用無菌水或適當的介質沖洗。
   注意：這種加工方法產生的不溶性絲膜材料特性往往是透明的，更親水，并且在原位降解速度快。

  1. 如果不立即使用，可以將薄膜切割成型并在室溫下儲存 2 年或更長時間。
    注意： 絲膜也可以澆鑄到帶圖案的表面上以復制表面形貌，通常使用硅橡膠或類似材料來輕松去除絲材料。此外，由于潛在的材料浮力，可能需要使用加權方法來保持薄膜浸沒在介質中。

4.  3D Silk Sponge Scaffolds： 這種處理方法為體外和體內應用或原位植入創建 3D 多孔支架。支架孔徑和可降解特性也可以使用以下方法進行調整。

A. 將蠶絲溶液等分到所需的成型容器中，建議使用聚四氟乙烯，以便于去除材料。

B. 對于每個正在制備的樣品，稱量必要量的鹽，以保持鹽與絲的重量比為 25:1。
注意：對孔徑的控制取決于所選的氯化鈉（鹽）晶體尺寸。如果確定的孔徑大小，請使用不銹鋼篩網以產生均勻的鹽晶體大小。對于 750 µm 及更大的鹽顆粒，建議將蠶絲溶液濃縮至 8% 或以上。

C. 在旋轉模具的同時將鹽緩慢添加到蠶絲溶液中，以使鹽添加均勻。確保通過輕微攪拌或敲擊表面小心去除因材料移位而形成的氣泡。

D. 蓋上模具，讓溶液在室溫下靜置 1-2 天，以形成絲質支架。

E. 支架形成后，取下模具蓋，將樣品放入 2 升 DI 燒杯中，然后放在攪拌板上。

F. 48小時內每8-12小時換一次水。

H. 洗滌期結束后，從模具中取出形成的支架并放入最后的去離子水中沖洗 24 小時，以確保*去除殘留的鹽分。

I. 支架可在去離子水中 4 °C 儲存或在室溫下干燥直至需要。

J. 腳手架可切割成所需尺寸并在使用前進行蒸汽滅菌

5. 3D Silk Hydrogels： 這種加工方法可用于生產絲水凝膠，用作可注射生物材料、體外培養和體內使用。

A. 將 5% 的絲溶液放入所需的成型容器或小瓶中。

B. 用膠帶將容器或小瓶垂直固定到實驗室渦旋儀上。

C. 以最大轉速渦旋溶液幾分鐘。這些參數需要針對給定的絲溶液體積和模具幾何形狀進行優化。

注意：例如，將 1 mL 的絲溶液移液到玻璃小瓶中，并在 3,200 RPM 下渦旋約 7 分鐘。溶液應增加濁度，表明膠凝過程已開始。

注意：一旦溶液被渦旋，在凝膠化完成之前不要將溶液轉移到第二個容器中。

D. 將渦旋絲/成型容器/小瓶置于 37 °C 培養箱中過夜，以加快凝膠時間。

E. 絲水凝膠只要保持水分并儲存在 4°C 的去離子水中，就可以用于未來使用。