1.紫外消毒30min后封閉紫外燈，敞開超凈臺正常作業(yè)狀況，用酒精消毒操作者的雙手。

2.將所需的培育基，胰酶確保瓶身潔凈后放于作業(yè)臺面內(nèi)，點燃酒精燈，將培育基和胰酶瓶口用酒精棉球擦洗后，再將瓶口對準(zhǔn)在酒精燈上消毒2-3次，旋開瓶蓋后再次分別消毒瓶口和瓶蓋，分別放于酒精燈的兩端。特別是將培育基瓶放于斜架上，瓶口對準(zhǔn)酒精燈，且放在間隔酒精燈近的方位，瓶蓋置于酒精燈的另一側(cè)。
    
3.將培育瓶瓶口在酒精燈上消毒2-3次，旋開后分別再次消毒瓶口和瓶蓋2-3次，蓋放于酒精燈右側(cè)后將培育瓶內(nèi)的培育液懸空倒進(jìn)污缸，在酒精燈消毒2-3次瓶口，豎直放好。取1ml移液器快速移動在酒精燈上消毒1-2次，然后再裝上槍頭招致1.5ml胰酶液，懸空移入培育瓶內(nèi)。

4.將培育使胰酶浸沒整個瓶壁的細(xì)胞層，計時約40s，立馬豎起對著燈光可調(diào)查到細(xì)胞與細(xì)胞之間有zhen孔樣縫隙，并有1-2個細(xì)胞掉落，這時為胰酶消化的適機(jī)遇。若看到成片的細(xì)胞從瓶壁掉落為胰酶消化過度；若看不到zhen孔樣縫隙和細(xì)胞掉落，則需繼續(xù)消化，悄然的活絡(luò)平放培育瓶使胰酶浸沒細(xì)胞層1s后活絡(luò)豎起對著燈光調(diào)查細(xì)胞狀況，可重復(fù)幾回，直至呈現(xiàn)zhen孔樣縫隙和1-2個細(xì)胞掉落的消化狀況。用移液器將胰酶吸凈。

5.招致1ml細(xì)胞凍存液于培育瓶內(nèi)，并用移液器招致少量的培育基輕柔的重復(fù)沖刷培育瓶壁5-8次，使貼壁細(xì)胞*掉落于培育基內(nèi)再悄然吹打2-3次，使細(xì)胞盡可能處于單個懸浮狀況。
6.將1ml含有細(xì)胞的凍存液移入新的保種管內(nèi)，擰緊瓶蓋，做好實驗符號。

7.將培育基瓶口和瓶蓋消毒2-3次后擰緊，停息酒精燈，拾掇實驗臺面，取出實驗試劑及污缸等，封閉超凈作業(yè)臺。

8.將保種管先放于4℃冰箱 30min后拿出放置-20℃冰箱過夜，次日再放于-80℃的冰箱內(nèi)3-4天，后存放于-196℃的液氮灌內(nèi)長期保存。

注此進(jìn)程也可簡化因?qū)嶋H操作進(jìn)程中閱歷所得：過程7完畢后將保種管用干脫脂棉包裹后膠帶封好直接放于-80℃冰箱內(nèi)4-5天，即可放于液氮灌保存。但-80℃冰箱也可保存細(xì)胞株2-3月。