?細胞名稱   NCI-H460-LUC人大細胞肺癌熒光素酶標記細胞 培養步驟
?組織:人大細胞系
?母細胞來源  客戶
?轉染方法與標記過程的描述 慢病毒轉染Hygromycin篩選 
1.質粒部分
1.酶切載體：pGL4.10（luc2）由酶切獲得1400bp的luc2基因片斷；EGFP和mCherry片段由PCR擴增獲得700-800bp左右片段；pSin-hyg-T2A載體酶切線性化。
2.電泳和膠回收：上述酶切產物DNA電泳，TAKARA試劑盒膠回收，回收產物取少量電泳鑒定。
3.連接載體與目的片段:使用Invitrogen T4連接酶連接luc2、EGFP或mCherry片段和pSin-hyg-T2A線性化載體，連接使用20ul體系，25℃，10min。
4.轉化：感受態菌One Shot Stbl3在冰上融化后，加入連接產物，靜置25min后在水浴42℃，45sec熱休克，后加入250ul無抗培養基225轉搖菌1h，將轉化的菌鋪于有氨芐抗性平板37度過夜。
5.挑取單克隆：觀察平板后挑取15個單克隆至含2ml氨芐抗性 LB培養基搖菌管中，255轉搖菌6.5h。
6.小抽質粒與鑒定：使用堿裂解法小抽，質粒用25ul含RNA酶ddH2O溶解；酶切鑒定: 重組質粒用通過酶切鑒定。
7.熒光素表達鑒定: 重組質粒pSin-hyg-GFP/luc2（以下簡稱Gluc）或pSin-hyg-mCherry/luc2（以下簡稱Mluc） 轉染293T細胞：DNA定量后，使用PEI轉染Gluc或Mluc至24孔板已預鋪的293T細胞中。轉染采用脂質體法轉染，試劑采用JetPEI (Polyplus公司)。兩管EP管中分別加入50ul生理鹽水，其中一管加入1ug量的質粒（DNA體積=1ug/DNA濃度），輕輕震蕩混勻，再輕微離心；在另一管中加入PEI 2ul輕輕震蕩混勻，輕微離心，然后把PEI管中的溶液加入含有的質粒管中，室溫孵育20min。將脂質體包繞DNA的混合液加入需要轉染的24孔內，37 ℃、5 % CO2條件下培養，8小時后換培養液。
8.報告基因檢測：Passive Lysis Agent裂解細胞，加入熒光素酶作用底物，將轉染質粒的細胞與陰性，陽性對照共同進行單報告基因檢測。
9.質粒中抽：取1ml轉染報告基因檢測正確的菌液加入100ml氨芐抗性的LB培養基中搖菌過夜，使用Invitrogen試劑盒中抽，產物電泳鑒定，－20℃保存。

NCI-H460-LUC人大細胞肺癌熒光素酶標記細胞 培養步驟
1.慢病毒包裝部分
1. 質粒共轉染細胞：轉染前一天，293T在10cm培養盤中的細胞達到90％，胰酶消化后，1：3傳入新10cm培養盤中。轉染時，細胞在培養盤中密度達到80％。采用脂質體PEI轉染法使編碼慢病毒包膜蛋白的質粒VSV G, Packaging Mix以及構建的Gluc或Mluc質粒15µg共轉染。6h后換新鮮DMEM培養基。
2．提取病毒上清：轉染48-72hours后，將含有病毒液的培養基轉移到15ml離心管中,在低溫4攝氏度條件下，3000rpm，離心10min去除片狀沉淀的細胞碎片。
3．濃縮病毒：將病毒上清用0.45um濾器過濾至濃縮離心管中，2000rpm，4℃，15min離心。濃縮液收集于500µl離心管中，-80℃保存。
1.慢病毒感染&篩選
1.感染前一天(Day1)，消化4T1細胞并計數，將細胞鋪于24孔板中（以便在感染前細胞達到30%-50%的匯合度，37°C過夜孵化細胞。
2.(Day2) 解凍低溫保存的慢病毒液，并且制備1：2病毒稀釋液200µl加入細胞中。
3.向每孔加入Polybrene達到終濃度6ug/ml，晃勻孔板，37度孵化過夜。
4.(Day3)移去含有慢病毒的培養基，加入500µl*培養基。
5.(Day4)換液，加入300µg/ml  Hygromycin（Sigma）來選擇穩定感染的細胞克隆。
6.(Day4－7），每24h換液，300µg/ml Hygromycin（Sigma）來選擇穩定感染的細胞克隆。
維持培養。
7.(Day8－12）細胞逐漸由24孔板傳入6孔板、6cm盤和10cm盤中100µg/ml Hygromycin維持培養。
8. 4T1-Gluc/Mluc細胞系鑒定: 取5×104細胞，用Passive Lysis裂解液裂解，加入熒光素酶作用底物，將轉染質粒的細胞與陰性，陽性對照共同進行單報告基因檢測。GFP和mCherry表達通過熒光顯微鏡觀察。
 
?培養條件 ：置于37℃、5％CO2培養箱中，用含10％胎牛血清（FBS;    Hyclone, Tauranga, New Zealand）和1％雙抗（100 U/ ml青霉素和100 μg/ ml鏈霉素，Hyclone, Logan, UT, USA）的高糖DMEM培養基培養，培養一天（密度大概80%）按照1：3的比例傳代。
?細胞傳代所需時間：1天/代 
?篩選標記維持壓力和選擇壓力：Hygromycin 100ug/ml 和300ug/ml 。
"NCI-H460 [H460] Cell<人大細胞肺癌細胞系>
細胞形態特性：詳見細胞說明書
778571-57-6
細胞生長特性：貼壁
冷凍細胞解凍程序：依據細胞株數據單之基礎培養基種類、血清種類和其它之成份和比例，制備培養基。絕大多數之細胞均無法立即適應不同之基礎培養基或不同之血清種類，若因實驗需要，必須有所不同時，務必以緩慢比例漸次改變培養基組成，確定細胞適應后，方進行所需之實驗。FBS(fetal bovine serum,胚牛血清), CS(calf serum,小牛血清)和HS(horse serum,馬血清)，對細胞而言差異極大，請務必依據細胞株資料單之血清種類培養之。將培養基置于３７°C水槽中回溫，回溫后噴以７０%酒精并擦拭之，移入無菌操作臺內。取出冷凍管，立即放入３７°C水槽中快速解凍，水面高度不可接近或高過冷凍管之蓋沿，否則易發生污染。輕搖冷凍管使其在１分鐘內全部融化后，以７０%ethanol擦拭冷凍管外部，移入無菌操作臺內。依據細胞種類和濃度，于無菌操作臺內取１０ml培養基加至T２５或T７５flask中。取出已解凍之細胞懸浮液，緩緩加入T２５或T７５flask內之培養基，混合均勻，放入３７°C，５%CO２培養箱培養。對絕大多數細胞而言，１%以下之冷凍保護劑DMSO，不會對細胞之貼附或活化有不良影響，不需立刻由解凍細胞中去除，待第二天確定細胞生長或貼附良好后再去除即可。惟對極少數因對DMSO敏感或會造成細胞分化之細胞，需立即去除DMSO者，則可將解凍后之細胞懸浮液放入５-１０ml培養基中，離心３００xg(約１０００rpm)，５分鐘，小心移去上清液，加入適量新鮮培養基，將細胞均勻混合后，轉移至培養瓶中，再放入３７°C，５%CO２培養箱培養。
NCI-H460 [H460] Cell<人大細胞肺癌細胞系>
細胞產品包裝：復蘇形式：T25培養瓶(一瓶)或凍存形式：1ml凍存管(兩支)
MDA-MB-175細胞系；細胞傳代方法：1：2—1：6傳代，每周換液2—3次；細胞形態特性：上皮細胞樣；細胞生長特性：松散貼壁；細胞背景資料：該細胞源自一位54歲患有乳腺導管癌白人女性的胸腔積液。
HCT116[HCT116]細胞系；細胞傳代方法：1：2-1：3傳代；每周換液2-3次；細胞形態特性：詳見細胞說明書；細胞生長特性：貼壁或懸浮，詳見細胞說明書部分；細胞背景資料：詳見相關文獻介紹
COV434細胞系；細胞傳代方法：1：2傳代；細胞形態特性：上皮細胞；細胞生長特性：貼壁生長；細胞背景資料：詳見相關文獻介紹
RC-4BC細胞系；細胞傳代方法：1：2-1：3傳代；每周換液2-3次；細胞形態特性：詳見細胞說明書；細胞生長特性：貼壁或懸浮，詳見細胞說明書部分；細胞背景資料：詳見相關文獻介紹
B16細胞系；細胞傳代方法：1：3傳代，2-3天換液一次；細胞形態特性：梭形；細胞生長特性：貼壁生長；細胞背景資料：該細胞源于C57BL/6J小鼠黑色素瘤，可以產生黑色素，同基因小鼠體內移植可成瘤
MEF-11細胞系；細胞傳代方法：1：2-1：3傳代；每周換液2-3次；細胞形態特性：詳見細胞說明書；細胞生長特性：貼壁或懸浮，詳見細胞說明書部分；細胞背景資料：詳見相關文獻介紹
細胞來源說明：細胞主要來源ATCC、DSMZ、ECACC、RIKEN、INCell、promocell、ScienCell、ECACC、JCRB、KCLB、Asterand、ICLC以及少數國外著名大學建系
細胞培養無菌操作步驟和注意事項：１.打開無菌工作臺及凈化室的紫外燈，消毒半小時以上。２.進入凈化室前先關閉紫外燈，打開超凈臺風機，等待３０min以上，以排盡臭氧。３.穿好隔離衣，戴好口罩，帽子。４.風淋２分鐘。５.０.１%水泡手，擦干。６.點燃酒精燈;超凈臺內應避免放入過多的物品;使用的吸管，滴管，試管，培養瓶等均事先滅菌。７.打開各類瓶蓋前先過火，以固定灰塵;打開的瓶口、試管口過火焰，鑷子使用前應經火焰燒灼。８.水平式風機的超凈臺，應使瓶口斜置，應盡量避免瓶口敞開直立。９.同一根吸管或滴管不應連續用于幾個不同的細胞系；吸取培養基的吸管應離開培養瓶或試管口０.５cm，避免伸入培養瓶口或試管口；以防止細胞系的互相混雜污染。１０.漏在培養瓶上或臺上的液體，立即用酒精棉球擦凈。１１.操作完畢后恢復工作臺面。
?體外實驗數據：
1.4T1-Gluc 和4T1-Mluc熒光顯微鏡照片(100×)：
2.細胞裂解液的發光值，數據—化學發光儀(Berthold Lumat LB 9501)檢測。