一、    細胞名稱 ：MGC-823-GFP人低分化前胃癌綠色標記細胞 處理方法

二、    組織：人的胃癌細胞

三、    母細胞來源  ATCC

四、    轉染方法與標記過程的描述 慢病毒轉染Hygromycin篩選

(一)     質粒部分

1.酶切載體：pGL4.10（luc2）由酶切獲得1400bp的luc2基因片斷；EGFP片段由PCR擴增獲得700-800bp左右片段；pSin-hyg-T2A載體酶切線性化。

2.電泳和膠回收：上述酶切產物DNA電泳，TAKARA試劑盒膠回收，回收產物取少量電泳鑒定。

3.連接載體與目的片段:使用Invitrogen T4連接酶連接luc2、EGFP片段和pSin-hyg-T2A線性化載體，連接使用20ul體系，25℃，10min。

4.轉化：感受態菌One Shot Stbl3在冰上融化后，加入連接產物，靜置25min后在水浴42℃，45sec熱休克，后加入250ul無抗培養基225轉搖菌1h，將轉化的菌鋪于有氨芐抗性平板37度過夜。

5.挑取單克隆：觀察平板后挑取15個單克隆至含2ml氨芐抗性 LB培養基搖菌管中，255轉搖菌6.5h。

6.小抽質粒與鑒定：使用堿裂解法小抽，質粒用25ul含RNA酶ddH2O溶解；酶切鑒定: 重組質粒用通過酶切鑒定。

7.熒光素表達鑒定: 重組質粒pSin-hyg-GFP/luc2（以下簡稱Gluc）轉染293T細胞：DNA定量后，使用PEI轉染Gluc至24孔板已預鋪的293T細胞中。轉染采用脂質體法轉染，試劑采用JetPEI (Polyplus公司)。兩管EP管中分別加入50ul生理鹽水，其中一管加入1ug量的質粒（DNA體積=1ug/DNA濃度），輕輕震蕩混勻，再輕微離心；在另一管中加入PEI 2ul輕輕震蕩混勻，輕微離心，然后把PEI管中的溶液加入含有的質粒管中，室溫孵育20min。將脂質體包繞DNA的混合液加入需要轉染的24孔內，37 ℃、5 % CO2條件下培養，8小時后換培養液。

MGC-823-GFP人低分化前胃癌綠色標記細胞 處理方法

操作流程

1、您收到PANC-1人胰腺癌細胞后，請按照以下方法進行操作：

取出25cm2培養瓶，75%酒精擦拭培養瓶，拆下封口膜，放入37℃，5%CO2細胞培養箱中靜置3-4小時以穩定細胞狀態，然后換用新鮮*培養液繼續培養或進行傳代。

2、細胞傳代：

1）細胞生長至覆蓋培養瓶的80%面積時，棄25cm2培養瓶中的培養液，用PBS清洗細胞一次；

2）添加0.25%胰蛋白酶消化液約1ml至培養瓶中，倒置顯微鏡下觀察，待細胞回縮變圓后加入*培養液終止消化，再輕輕吹打細胞使之脫落，然后將懸液轉移至15ml離心管中，1000rpm離心5min；

3）棄上清，沉淀細胞用12ml*培養基重懸，然后按1:2比例進行分瓶傳代，*后放入37℃，5%CO2細胞培養箱中培養；

4）待細胞*貼壁后，觀察培養結果，之后進行換液培養或傳代。

3、細胞凍存：

1）細胞生長至覆蓋培養瓶的80%面積時，棄25cm2培養瓶中的培養液，用PBS清洗細胞一次；

2）添加0.25%胰蛋白酶消化液約1ml至培養瓶中，倒置顯微鏡下觀察，待細胞回縮變圓后加入*培養液終止消化，輕輕吹打細胞使之脫落，然后將懸液轉移至15ml離心管中，1000rpm離心5min；

3）用適量的凍存液（FBS：DMSO=9 ：1）重懸細胞，并放置于凍存管中；

4）先將細胞凍存管放置于-20℃ 1.5h，然后將其移入-80℃過夜，24h后轉入液氮中進行長期保存。使用程序降溫盒可直接放入-80℃。 

4、細胞復蘇：
1）從液氮中取出細胞凍存管（注意：佩戴防爆管面具），快速將其置入37℃水浴中解凍，直至凍存管中無結晶，然后用75%的酒精擦拭凍存管外壁；
2）將凍存管中的細胞移至含5ml*培養基的15ml離心管中， 1000rpm離心5min；

3）棄上清，沉淀用5ml*培養基重懸，接種25cm2培養瓶，于37℃，5%CO2細胞培養箱中培養；

4）第二天，換用新鮮*培養基繼續培養。

訂購說明

PANC-1人胰腺癌細胞發貨采取專業的運輸包裝，并選擇快捷的運輸方式（順豐速運或其他空運快遞）
 本公司細胞引種來源：ATCC、DSMZ、ECACC、武大細胞庫、上海生化細胞所、中國科學院典型培養物保藏委員會等

 
細胞處理方法：
一、貼壁細胞
1、 接收到細胞，肉眼觀察細胞培養基顏色，顯微鏡觀察細胞生長情況，并對細胞進行不同倍數拍照（建議收到時的培養瓶拍一張照片，顯微鏡拍收到時的細胞 100X,200X 各一張）。
2、用 75%的酒精消毒外包裝,在超凈工作臺內打開外包裝。
3、嚴格遵循無菌操作規范，打開細胞培養瓶。
4、37度平衡1-2小時。
5、用移液管吸取培養基，到50ml離心管中，剩下細胞密度達到80%至90%可以傳代，如沒有達到添加6ml新鮮培養基繼續培養。
6、如果肉眼檢查上清有細胞，對50ml上清進行離心收集細胞，如果細胞連片狀態，棄掉上清對收集的細胞進行胰酶消化（1ml胰酶37度），接種培養。
 
二、懸浮細胞
1、接收到細胞，肉眼觀察細胞培養基顏色，顯微鏡觀察細胞生長情況，并對細胞進行不同倍數拍照（建議收到時的培養瓶拍一張照片，顯微鏡拍收到時的細胞 100X,200X 各一張）。
2、用 75%的酒精消毒外包裝,在超凈工作臺內打開外包裝。
3、嚴格遵循無菌操作規范，打開細胞培養瓶。
4、細胞培養瓶內的培養基用吸管*吸出（嚴禁直接傾倒）。
5、1000rpm，5min 離心，用吸管小心吸出上清，加入培養基，重懸細胞。
6、將重懸好的細胞轉入六孔板或者細胞培養瓶種，加入新鮮培養基，置于 37℃，5%CO2 培養（大部分細胞）。
 
培養操作：細胞培養操作指南
細胞常見問題分析：細胞培養常見問題分析
 
細胞在發貨前進行質檢：
1、細胞存種的活性檢測
2、細菌、真菌、霉菌污染物鏡檢
3、衣原體、支原體檢測（熒光法、培養法等）
 
產品質量保證及售后：
1、 細胞為三代以內，活體。運輸過程中細胞出現污染和狀態不好，我們*免費重新發貨。
2、 實驗過程中若確定是客戶問題，客戶僅需支付物流和耗材費用，我們可重新發貨。其他根據情況靈活處理。
3、 產品使用過程中，可提供技術上的指南