LOVO-LUC人結腸癌熒光素酶標記細胞 處理方法

· 細胞名稱   LOVO-LUC人結腸癌熒光素酶標記細胞

· 組織  人結腸癌細胞系

· 母細胞來源  客戶

· 轉染方法與標記過程的描述 慢病毒轉染Hygromycin篩選 

1. 質粒部分

1.酶切載體：pGL4.10（luc2）由酶切獲得1400bp的luc2基因片斷；EGFP和mCherry片段由PCR擴增獲得700-800bp左右片段；pSin-hyg-T2A載體酶切線性化。

2.電泳和膠回收：上述酶切產物DNA電泳，TAKARA試劑盒膠回收，回收產物取少量電泳鑒定。

3.連接載體與目的片段:使用Invitrogen T4連接酶連接luc2、EGFP或mCherry片段和pSin-hyg-T2A線性化載體，連接使用20ul體系，25℃，10min。

4.轉化：感受態菌One Shot Stbl3在冰上融化后，加入連接產物，靜置25min后在水浴42℃，45sec熱休克，后加入250ul無抗培養基225轉搖菌1h，將轉化的菌鋪于有氨芐抗性平板37度過夜。

5.挑取單克?。河^察平板后挑取15個單克隆至含2ml氨芐抗性 LB培養基搖菌管中，255轉搖菌6.5h。

6.小抽質粒與鑒定：使用堿裂解法小抽，質粒用25ul含RNA酶ddH2O溶解；酶切鑒定: 重組質粒用通過酶切鑒定。

7.熒光素表達鑒定: 重組質粒pSin-hyg-GFP/luc2（以下簡稱Gluc）或pSin-hyg-mCherry/luc2（以下簡稱Mluc） 轉染293T細胞：DNA定量后，使用PEI轉染Gluc或Mluc至24孔板已預鋪的293T細胞中。轉染采用脂質體法轉染，試劑采用JetPEI (Polyplus公司)。兩管EP管中分別加入50ul生理鹽水，其中一管加入1ug量的質粒（DNA體積=1ug/DNA濃度），輕輕震蕩混勻，再輕微離心；在另一管中加入PEI 2ul輕輕震蕩混勻，輕微離心，然后把PEI管中的溶液加入含有的質粒管中，室溫孵育20min。將脂質體包繞DNA的混合液加入需要轉染的24孔內，37 ℃、5 % CO2條件下培養，8小時后換培養液。

8.報告基因檢測：Passive Lysis Agent裂解細胞，加入熒光素酶作用底物，將轉染質粒的細胞與陰性，陽性對照共同進行單報告基因檢測。

9.質粒中抽：取1ml轉染報告基因檢測正確的菌液加入100ml氨芐抗性的LB培養基中搖菌過夜，使用Invitrogen試劑盒中抽，產物電泳鑒定，－20℃保存。

LOVO-LUC人結腸癌熒光素酶標記細胞 處理方法

1. 慢病毒包裝部分

1. 質粒共轉染細胞：轉染前一天，293T在10cm培養盤中的細胞達到90％，胰酶消化后，1：3傳入新10cm培養盤中。轉染時，細胞在培養盤中密度達到80％。采用脂質體PEI轉染法使編碼慢病毒包膜蛋白的質粒VSV G, Packaging Mix以及構建的Gluc或Mluc質粒15µg共轉染。6h后換新鮮DMEM培養基。

2．提取病毒上清：轉染48-72hours后，將含有病毒液的培養基轉移到15ml離心管中,在低溫4攝氏度條件下，3000rpm，離心10min去除片狀沉淀的細胞碎片。

3．濃縮病毒：將病毒上清用0.45um濾器過濾至濃縮離心管中，2000rpm，4℃，15min離心。濃縮液收集于500µl離心管中，-80℃保存。

1. 慢病毒感染&篩選

1.感染前一天(Day1)，消化4T1細胞并計數，將細胞鋪于24孔板中（以便在感染前細胞達到30%-50%的匯合度，37°C過夜孵化細胞。

2.(Day2) 解凍低溫保存的慢病毒液，并且制備1：2病毒稀釋液200µl加入細胞中。

3.向每孔加入Polybrene達到終濃度6ug/ml，晃勻孔板，37度孵化過夜。

4.(Day3)移去含有慢病毒的培養基，加入500µl*培養基。

5.(Day4)換液，加入300µg/ml  Hygromycin（Sigma）來選擇穩定感染的細胞克隆。

6.(Day4－7），每24h換液，300µg/ml Hygromycin（Sigma）來選擇穩定感染的細胞克隆。

維持培養。

7.(Day8－12）細胞逐漸由24孔板傳入6孔板、6cm盤和10cm盤中100µg/ml Hygromycin維持培養。

8. 4T1-Gluc/Mluc細胞系鑒定: 取5×10⁴細胞，用Passive Lysis裂解液裂解，加入熒光素酶作用底物，將轉染質粒的細胞與陰性，陽性對照共同進行單報告基因檢測。GFP和mCherry表達通過熒光顯微鏡觀察。

· 培養條件 ：置于37℃、5％CO₂培養箱中，用含10％胎牛血清（FBS;    Hyclone, Tauranga, New Zealand）和1％雙抗（100 U/ ml青霉素和100 μg/ ml鏈霉素，Hyclone, Logan, UT, USA）的高糖DMEM培養基培養，培養一天（密度大概80%）按照1：3的比例傳代。

· 細胞傳代所需時間：1天/代 

· 篩選標記維持壓力和選擇壓力：Hygromycin 100ug/ml 和300ug/ml 。

· 體外實驗數據：

1. LOVO-LUC人結腸癌熒光素酶標記細胞 和4T1-Mluc熒光顯微鏡照片(100×)：

2. 細胞裂解液的發光值，數據—化學發光儀(Berthold Lumat LB 9501)檢測。