MTT主要有兩個(gè)用途：

1. 藥物（也包括其他處理方式如放射線照射）對(duì)體外培養(yǎng)的細(xì)胞毒性的測(cè)定；

2. 細(xì)胞增殖及細(xì)胞活性測(cè)定。

檢測(cè)原理為活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲臜（Formazan）并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無(wú)此功能。二甲基亞砜（DMSO）能溶解細(xì)胞中的甲臜，用酶標(biāo)儀在490nm波長(zhǎng)處測(cè)定其光吸收值，在一定細(xì)胞數(shù)范圍內(nèi)，MTT結(jié)晶形成的量與細(xì)胞數(shù)成正比。

根據(jù)測(cè)得的吸光度值（OD值），來(lái)判斷活細(xì)胞數(shù)量，OD 值越大，細(xì)胞活性越強(qiáng)（如果是測(cè)藥物毒性，則表示藥物毒性越?。?。

貼壁細(xì)胞：

1、收集對(duì)數(shù)期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度，每孔加入100ul,鋪板使待測(cè)細(xì)胞調(diào)密度至1000-10000孔，（邊緣孔用無(wú)菌PBS填充）。

2.、5%CO2，37℃孵育，至細(xì)胞單層鋪滿孔底（96孔平底板）,加入濃度梯度的藥物,原則上，細(xì)胞貼壁后即可加藥，或兩小時(shí)，或半天時(shí)間，但我們常在前一天下午鋪板，次日上午加藥.一般5-7個(gè)梯度,每孔100ul,設(shè)3-5個(gè)復(fù)孔.建議設(shè)5個(gè)，否則難以反應(yīng)真實(shí)情況

3、5%CO2，37℃孵育16-48小時(shí)，倒置顯微鏡下觀察。

4、每孔加入20ulMTT溶液（5mg/ml，即0.5%MTT），繼續(xù)培養(yǎng)4h。若藥物與MTT能夠反應(yīng)，可先離心后棄去培養(yǎng)液，小心用PBS沖2-3遍后，再加入含MTT的培養(yǎng)液。

5、終止培養(yǎng)，小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液。

6、每孔加入150ul二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10min，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀OD490nm處測(cè)量各孔的吸光值。

7、同時(shí)設(shè)置調(diào)零孔（培養(yǎng)基、MTT、二甲基亞砜），對(duì)照孔（細(xì)胞、相同濃度的藥物溶解介質(zhì)、培養(yǎng)液、MTT、二甲基亞砜）。

懸浮細(xì)胞：

1、收集對(duì)數(shù)期細(xì)胞，調(diào)節(jié)細(xì)胞懸液濃度1×106/ml，按次序?qū)ⅲ?/p>

① 補(bǔ)足的1640（無(wú)血清）培養(yǎng)基40ul；

② 加Actinomycin D（有毒性）10ul用培養(yǎng)液稀釋 （儲(chǔ)存液100mg/ml，需預(yù)試尋找*稀釋度，1:10-1:20）；

③ 需檢測(cè)物10ul；

④ 細(xì)胞懸液50ul（即5×104cell/孔），共 100ul加入到96孔板（邊緣孔用無(wú)菌水填充）。每板設(shè)對(duì)照（加100ml 1640）。

2、置37℃，5%CO2孵育16-48小時(shí)，倒置顯微鏡下觀察。

3、每孔加入10 ul MTT溶液（5 mg/ml，即0.5%MTT），繼續(xù)培養(yǎng)4 h。（懸浮細(xì)胞推薦使用WST-1，培養(yǎng)4 h后可跳過(guò)步驟4），直接酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀OD570nm（630nm校準(zhǔn)）測(cè)量各孔的吸光值）

4、離心（1000轉(zhuǎn)x10min），小心吸掉上清，每孔加入100 ul二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀OD570nm（630nm校準(zhǔn)）測(cè)量各孔的吸光值。

5、同時(shí)設(shè)置調(diào)零孔（培養(yǎng)基、MTT、二甲基亞砜），對(duì)照孔，每組設(shè)定3復(fù)孔。