KB-LUC人口腔上皮癌熒光素酶標記細胞培養步驟 含STR鑒定

細胞英文(簡稱）：KB

細胞名稱：KB人口腔上皮癌細胞【已通過STR鑒定】

背景資料

初認為這個細胞源自口腔表皮癌，但隨后通過同工酶分析、HeLa標記染色體和DNA指紋分析發現，起源細胞已被HeLa污染。角蛋白陽性。有報告稱，KB細胞含有人乳頭狀瘤病毒18 (HPV-18)序列。 

細胞來源：ATCC CCL-17

代次：P3

規格：T25

細胞數：1x10^6 cells

組織來源：口腔上皮

KB人口腔上皮癌細胞【已通過STR鑒定】形態：貼壁；上皮細胞樣

細胞活力：95％（Viability by Trypan Blue Exclusion）

細胞檢測：細胞不含有HIV-1、HBV、HCV、支原體、細菌、酵母和真菌

培養條件：RPMI-1640 +10% FBS；37℃，5% CO2

傳代方法：*建議1:2-1:3 兩天換液一次

凍存條件：90%FBS+10%DMSO

動物細胞培養,大致的步驟是這樣:

1.從動物胚胎或者一些剛出生的動物的器官或者組織上取得細胞,配制成細胞懸浮液.把細胞液放到培養瓶中,在培養箱里培養--------原代培養.

但是,不要以為這樣就能一直無限培養下去.

因為KB人口腔上皮癌細胞【已通過STR鑒定】在那個瓶壁上生長的時候,如果大量增殖,細胞之間會彼此相碰,細胞細胞就會停止分裂增殖,出現一種接觸抑制.

2.我們為了它們能繼續增殖,就用胰蛋白酶再把它們分開,然后再配制成細胞懸浮液,分開裝到好幾個瓶子里繼續培養--------傳代培養.

細胞株&細胞系

1.它們都是傳代培養里面的概念.都是10代以后的

2.細胞株是傳代培養里10~50（不同物種不同組織細胞有差別吧）代,細胞系是50代以后的;

3.對于細胞繁殖而言,傳到10代就很不容易了,所以細胞株是極少數的細胞

4.50代以后,細胞繁殖會出現另一個危機,基本上沒有什么細胞能再傳下去了.但是,有細胞發生了基因突變,像一個癌細胞一樣無限地分裂下去,這就是細胞系.

KB-LUC人口腔上皮癌熒光素酶標記細胞培養步驟 含STR鑒定
1.慢病毒包裝部分
1. 質粒共轉染細胞：轉染前一天，293T在10cm培養盤中的細胞達到90％，胰酶消化后，1：3傳入新10cm培養盤中。轉染時，細胞在培養盤中密度達到80％。采用脂質體PEI轉染法使編碼慢病毒包膜蛋白的質粒VSV G, Packaging Mix以及構建的Gluc或Mluc質粒15µg共轉染。6h后換新鮮DMEM培養基。
2．提取病毒上清：轉染48-72hours后，將含有病毒液的培養基轉移到15ml離心管中,在低溫4攝氏度條件下，3000rpm，離心10min去除片狀沉淀的細胞碎片。
3．濃縮病毒：將病毒上清用0.45um濾器過濾至濃縮離心管中，2000rpm，4℃，15min離心。濃縮液收集于500µl離心管中，-80℃保存。
1.慢病毒感染&篩選
1.感染前一天(Day1)，消化4T1細胞并計數，將細胞鋪于24孔板中（以便在感染前細胞達到30%-50%的匯合度，37°C過夜孵化細胞。
2.(Day2) 解凍低溫保存的慢病毒液，并且制備1：2病毒稀釋液200µl加入細胞中。
3.向每孔加入Polybrene達到終濃度6ug/ml，晃勻孔板，37度孵化過夜。
4.(Day3)移去含有慢病毒的培養基，加入500µl*培養基。
5.(Day4)換液，加入300µg/ml  Hygromycin（Sigma）來選擇穩定感染的細胞克隆。
6.(Day4－7），每24h換液，300µg/ml Hygromycin（Sigma）來選擇穩定感染的細胞克隆。
維持培養。
7.(Day8－12）細胞逐漸由24孔板傳入6孔板、6cm盤和10cm盤中100µg/ml Hygromycin維持培養。
8. 4T1-Gluc/Mluc細胞系鑒定: 取5×104細胞，用Passive Lysis裂解液裂解，加入熒光素酶作用底物，將轉染質粒的細胞與陰性，陽性對照共同進行單報告基因檢測。GFP和mCherry表達通過熒光顯微鏡觀察。