HEC-1-A-LUC人子宮內(nèi)膜腺癌細胞-熒光素酶標記 培養(yǎng)步驟

1.慢病毒包裝部分
1. 質粒共轉染細胞：轉染前一天，293T在10cm培養(yǎng)盤中的細胞達到90％，胰酶消化后，1：3傳入新10cm培養(yǎng)盤中。轉染時，細胞在培養(yǎng)盤中密度達到80％。采用脂質體PEI轉染法使編碼慢病毒包膜蛋白的質粒VSV G, Packaging Mix以及構建的Gluc或Mluc質粒15µg共轉染。6h后換新鮮DMEM培養(yǎng)基。
2．提取病毒上清：轉染48-72hours后，將含有病毒液的培養(yǎng)基轉移到15ml離心管中,在低溫4攝氏度條件下，3000rpm，離心10min去除片狀沉淀的細胞碎片。
3．濃縮病毒：將病毒上清用0.45um濾器過濾至濃縮離心管中，2000rpm，4℃，15min離心。濃縮液收集于500µl離心管中，-80℃保存。
1.慢病毒感染&篩選
1.感染前一天(Day1)，消化4T1細胞并計數(shù)，將細胞鋪于24孔板中（以便在感染前細胞達到30%-50%的匯合度，37°C過夜孵化細胞。
2.(Day2) 解凍低溫保存的慢病毒液，并且制備1：2病毒稀釋液200µl加入細胞中。
3.向每孔加入Polybrene達到終濃度6ug/ml，晃勻孔板，37度孵化過夜。
4.(Day3)移去含有慢病毒的培養(yǎng)基，加入500µl*培養(yǎng)基。
5.(Day4)換液，加入300µg/ml  Hygromycin（Sigma）來選擇穩(wěn)定感染的細胞克隆。
6.(Day4－7），每24h換液，300µg/ml Hygromycin（Sigma）來選擇穩(wěn)定感染的細胞克隆。
維持培養(yǎng)。
7.(Day8－12）細胞逐漸由24孔板傳入6孔板、6cm盤和10cm盤中100µg/ml Hygromycin維持培養(yǎng)。
8. 4T1-Gluc/Mluc細胞系鑒定: 取5×104細胞，用Passive Lysis裂解液裂解，加入熒光素酶作用底物，將轉染質粒的細胞與陰性，陽性對照共同進行單報告基因檢測。GFP和mCherry表達通過熒光顯微鏡觀察。

HEC-1-A-LUC人子宮內(nèi)膜腺癌細胞-熒光素酶標記 培養(yǎng)步驟
細胞冷凍及保存方法：

（1）干冰運輸，收到后立即轉入液氮凍存或直接復蘇；

（2）HBL-100    人整合SV40基因的乳腺上皮細胞存活細胞，收到后應繼續(xù)生長，傳代達到細胞生長狀態(tài)良好時，再進行凍存。

HBL-100    人整合SV40基因的乳腺上皮細胞培養(yǎng)方法如下：

1、將細胞稀釋到1000個細胞/mL，接種到24孔板，每孔1ml。

2、接種后第二天在100ug/mL~1mg/mL的G418濃度范圍內(nèi)進行篩選。

3、每隔3天跟換1次培養(yǎng)液，保持G418濃度不變。

4、選擇出在10~14天內(nèi)使HBL-100    人整合SV40基因的乳腺上皮細胞全部死亡的低G418濃度來進行下一步的篩選試驗。由于每種細胞對G418的敏感性不同，一般變動在100ug/ml～1000ug/ml范圍。

HBL-100    人整合SV40基因的乳腺上皮細胞來源于ATCC、ECACC、DSMZ、JCRB等，購買到貨后，由我們實驗室擴增、凍存，凍存的產(chǎn)品全部經(jīng)過QC檢測，100%進口來源，100%保證5代以內(nèi)，活力>95%，無細菌、真菌、支原體污染。

HEC-1-A人子宮內(nèi)膜腺癌細胞|HEC-1-A細胞  培養(yǎng)操作
1）復蘇細胞：將含有 1mL 細胞懸液的凍存管在 37℃水浴中迅速搖晃解凍，加 入 4mL 培養(yǎng)基混合均 勻。在 1000RPM 條件下離心 4 分鐘，棄去上清液，補 加 1-2mL 培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細胞懸液加入培養(yǎng)瓶中培 養(yǎng)過夜（或將 細胞懸液加入 10cm 皿中，加入約 8ml 培養(yǎng)基，培養(yǎng)過夜）。第二天換液并 檢查細胞密度。

 2）細胞傳代：如果細胞密度達 80%-90%，即可進行傳代培養(yǎng)。      
   
     1. 棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的 PBS 潤洗細胞 1-2 次。

     2. 加 1ml 消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，置于 37℃培 養(yǎng)箱中消化 1-2 分鐘，然后在顯微鏡下觀察細胞消化情況，若細胞大部分 變圓并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養(yǎng) 瓶后加少量培養(yǎng)基終止消 化。  
   
     3. 按 6-8ml/瓶補加培養(yǎng)基，輕輕打勻后吸出，在 1000RPM 條件下離心 4 分 鐘，棄去上清液，補加 1-2mL 培養(yǎng)液后吹勻。

     4. 將細胞懸液按 1：2 比例分到新的含 8ml 培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。

 3）細胞凍存：待細胞生長狀態(tài)良好時，可進行細胞凍存。下面 T25 瓶為類；

    1. 細胞凍存時，棄去培養(yǎng)基后，PBS 清洗一遍后加入 1ml 胰酶，細胞變圓 脫 落后，加入 1ml 含血清的培養(yǎng)基終止消化，可使用血球計數(shù)板計數(shù)。

    2. 4 min 1000rpm 離心去掉上清。加 1ml 血清重懸細胞，根據(jù)細胞數(shù)量加 入血 清和 DMSO，輕輕混勻，DMSO 終濃度為 10%，細胞密度不低于1x106/ml，每支凍存管凍存 1ml 細胞懸液，注意凍 存管做好標識。

    3. 將凍存管置于程序降溫盒中，放入-80 度冰箱，2 個小時以后轉入液氮灌儲存。記錄凍存管位置以便下次拿取。

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后，通過低溫保藏儲備一些細胞，以防支原體大面積來襲。如果支原體有抬頭的跡象，或常規(guī)檢測呈陽性結果，那么較可靠的補救措施是扔掉所有培養(yǎng)物，清潔培養(yǎng)箱和超凈臺，一切從頭開始。當然，你得確保儲備的細胞是不含支原體的。