人A組鏈球菌菌壁多糖抗體(ASP)ELISA試劑盒操作步驟相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究：

風(fēng)濕性心臟病急性期應(yīng)用鏈球菌菌壁多糖抗體的診斷價(jià)值
摘要：探討應(yīng)用A組鏈球菌菌壁多糖抗體(ASP)對(duì)慢性風(fēng)濕性心臟病患者風(fēng)濕活動(dòng)的判斷價(jià)值。方法入選2008年6月至2012年5月間住院的92例慢性風(fēng)濕性心臟病患者,入院時(shí)進(jìn)行血沉(ESR)、C反應(yīng)蛋白(CRP)、抗鏈球菌溶血素O(ASO)常規(guī)檢測(cè),以及心電圖、超聲心動(dòng)圖等檢查,應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)測(cè)定入院時(shí)患者血清ASP,根據(jù)臨床綜合判斷風(fēng)濕性心臟病患者有無(wú)風(fēng)濕活動(dòng),計(jì)算并比較ASP及ASO/ESR/CRP串聯(lián)試驗(yàn)對(duì)風(fēng)濕活動(dòng)的判斷價(jià)值。結(jié)果對(duì)于風(fēng)濕性心臟病風(fēng)濕活動(dòng)的診斷:(1)ASO/ESR/CRP串聯(lián)試驗(yàn)對(duì)診斷的敏感性68.0%,特異性50.0%,假陽(yáng)性率50.0%,假陰性率32.0%,陽(yáng)性預(yù)測(cè)值61.8%,陰性預(yù)測(cè)值56.8%,準(zhǔn)確度59.8%,陽(yáng)性似然比1.36。(2)ASP對(duì)診斷的敏感性83.3%,特異性73.7%,陽(yáng)性預(yù)測(cè)值81.8%,陰性預(yù)測(cè)值75.7%,準(zhǔn)確度79.3%,陽(yáng)性似然比3.17;經(jīng)Kappa檢驗(yàn),ASP檢測(cè)與臨床診斷的*性,K=0.572,SE=0.087,P<0.01。(3)ASP檢測(cè)的敏感性與特異性均高于ASO/ESR/CRP串聯(lián)試驗(yàn)。
試劑盒的組成： 
（1）結(jié)合物及標(biāo)本的稀釋液；
（2）洗滌液，在板式ELISA中，常用的稀釋液為含0.05%吐溫20磷酸緩沖鹽水；
（3）酶標(biāo)記的抗原或抗體（結(jié)合物）；
（4）酶的底物；
（5）陰性對(duì)照品和陽(yáng)性對(duì)照品（定性測(cè)定中），elisa試劑盒參考標(biāo)準(zhǔn)品和控制血清（定量測(cè)定中）；
（6）已包被抗原或抗體的固相載體（免疫吸附劑）
用途：科研與實(shí)驗(yàn)試劑，不得用于臨床診斷。
檢測(cè)種屬：人、大小鼠、兔、羊、猴、豬、豚鼠ELISA檢測(cè)試劑盒等種屬。
標(biāo)本：血清、血漿、細(xì)胞上清液、尿液、體液、灌洗液、腦脊髓、心房水、胸房水、組織等。 
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人A組鏈球菌菌壁多糖抗體(ASP)ELISA試劑盒雙抗體夾心ELISA法定量測(cè)定人血清、血漿、組織勻漿、細(xì)胞裂解液、細(xì)胞培養(yǎng)上清液和其他生物液體含量。

液體類(lèi)標(biāo)本：
包括血清，血漿，尿液，胸腹水，腦脊液，細(xì)胞培養(yǎng)上清液等。
血清：
室溫血液自然凝固10-20分鐘后，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分），仔細(xì)收集上清，如保存過(guò)程中如有沉淀，請(qǐng)?jiān)俅坞x心。
血漿：
應(yīng)根據(jù)標(biāo)本的要求選擇EDTA，檸檬酸鈉或者肝素作為抗凝劑，混合10-20分鐘后，在離心20分鐘（2000-3000轉(zhuǎn)/分），仔細(xì)收集上清，如保存過(guò)程中有沉淀，請(qǐng)?jiān)俅坞x心。
尿液：
用無(wú)菌管收集，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分），仔細(xì)收集上清，如保存過(guò)程中有沉淀，請(qǐng)?jiān)俅坞x心。
細(xì)胞培養(yǎng)上清：
檢測(cè)分泌性的成份時(shí)，用無(wú)菌管收集，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分），仔細(xì)收集上清。檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的成份時(shí)，用PBS（PH7.2-7.4）稀釋細(xì)胞懸液，當(dāng)細(xì)胞濃度達(dá)到100萬(wàn)/ml左右，通過(guò)反復(fù)凍融，使細(xì)胞破壞并釋放細(xì)胞內(nèi)的成份，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分），仔細(xì)收集上清，如保存過(guò)程中有沉淀，請(qǐng)?jiān)俅坞x心。
組織標(biāo)本：
切割標(biāo)本后，稱(chēng)取重量，加入一定量的PBS（PH7.4），用液氮迅速冷凍保存?zhèn)溆?，?biāo)本融化后仍保持2-8℃的溫度，加入一定量的PBS（PH7.4），用手工或勻漿器將標(biāo)本勻漿充分，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分），仔細(xì)收集上清，分裝后留一份待檢測(cè)，其余冷凍備用。

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ELISA試劑盒的包被條件與封閉：包被用抗原或抗體的濃度，包被的溫度和時(shí)間，包被液的pH等應(yīng)根據(jù)試驗(yàn)的特點(diǎn)和材料的性質(zhì)而選定。抗體和蛋白質(zhì)抗原一般采用pH9.6的碳酸鹽緩沖液作為稀釋液，也有用pH7.2的磷酸鹽緩沖液及pH7~8的Tris-HCL緩沖液作為稀釋液的。通常在ELISA板孔中加入包被液后，在4-8℃冰箱中放置過(guò)夜，37℃中保溫2小時(shí)被認(rèn)為具有同等的包被效果。包被的zui適當(dāng)濃度隨載體和?？贵w和蛋白質(zhì)抗原一般采用pH9.6的碳酸鹽緩沖液作為稀釋液，也有用pH7.2的磷酸鹽緩沖液及pH7~8的Tris-HCL緩沖液作為稀釋液的。通常在ELISA板孔中加入包被液后，在4-8℃冰箱中放置過(guò)夜，37℃中保溫2小時(shí)被認(rèn)為具有同等的包被效果。包被的zui適當(dāng)濃度隨載體和包被物的性質(zhì)可有很大的變化，每批材料需通過(guò)實(shí)驗(yàn)與酶結(jié)合物的濃度協(xié)調(diào)選定。一般蛋白質(zhì)的包被濃度為100ng/ml-20ug/ml。
封閉(blocking)是繼包被之后用高濃度的無(wú)關(guān)蛋白質(zhì)溶液再包被的過(guò)程?？乖蚩贵w包被時(shí)所用的濃度較低，吸收后固相載體表面尚有未被占據(jù)的空隙，封閉就是讓大量不相關(guān)的蛋白質(zhì)充填這些空隙，從而排斥在ELISA其后的步驟中干擾物質(zhì)的再吸附。封閉的手續(xù)與包被相類(lèi)似。zui常用的封閉劑是0.05%-0.5%的牛血清白蛋白，也有用10%的小牛血清或1%明膠作為封閉劑的。脫脂奶粉也是一種良好的封閉劑，其zui大的特點(diǎn)是價(jià)廉，可以高濃度使用（5%）。高質(zhì)量的速溶食用低脂奶粉即可直接當(dāng)作封閉劑使用，但由于奶粉的成份復(fù)雜，而且封閉后的載體不易長(zhǎng)期保存，因此在試劑盒的制備中較少應(yīng)用。 
封閉是否必要，取決于ELISA的模式及具體的實(shí)驗(yàn)條件。并非所有的ELISA固相均需封閉，封閉不當(dāng)反而會(huì)使陰性本底增高。一般說(shuō)來(lái)，雙抗體夾心法，只要酶標(biāo)記物是高活性的，操作時(shí)洗滌*，不經(jīng)封閉也可得到滿意的結(jié)果。特別是用單抗腹水直接包被時(shí)，因其中大量非抗體蛋白在包被時(shí)同樣也吸附在固相表面，業(yè)已起到了類(lèi)似封閉劑的作用。但在間接法測(cè)定中，封閉一般是不可少的。包被好的ELISA板干燥后放入密封袋或錫袋中，在低溫可保存數(shù)月。