DLD-1-GFP人結直腸腺癌上皮細胞-綠色標記細胞 培養步驟

中文名稱：DLD-1-GFP人結直腸腺癌上皮細胞-綠色標記細胞 已通過STR鑒定

規格：T25

形態特征：

生長狀態：成纖維細胞樣

特征特性：貼壁生長

培養條件：DMEM(高糖）+10%FBS（推薦HAKATA優等胎牛血清貨號：HN-FBS-500）

傳代方法：消化3-5分鐘。1:2。3天內可長滿。

凍存條件無血清凍存液規格：100ML

支原體檢測：陰性

使用權限：A類

參考文獻：

供應商：上海琛藝實業有限公司

復蘇周期：10個工作日左右

培養步驟：

1）復蘇細胞：將含有1mL細胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入5mL培養基混合均勻。在1000RPM條件下離心5分鐘，棄去上清液，補加4-6mL*培養基后吹勻。然后將所有細胞懸液加入培養瓶中培養過夜（或將細胞懸液加入6cm皿中），培養過夜。第二天換液并檢查細胞密度。

2）細胞傳代：如果細胞密度達80%-90%，即可進行傳代培養。

1、對于貼壁細胞，傳代可參考以下方法：

1. 棄去培養上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細胞1-2次。

2. 加1-2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養瓶中，置于37℃培養箱中消化1-2min，然后在顯微鏡下觀察細胞消化情況，若細胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養瓶后加5ml以上含10%血清的*培養基終止消化。

3.輕輕吹打細胞，*脫落后吸出，在1000RPM條件下離心8-10分鐘，棄去上清液，補加1-2mL培養液后吹勻。

4. 按5-6ml/瓶補加培養液，將細胞懸液按1：2到1：5的比例分到新的含5-6 ml培養液的新皿中或者瓶中。

PS：若客戶收到2ml小管細胞，收到細胞后，用75%酒精噴灑整個管子消毒后放到超凈臺或安全柜內，嚴格無菌操作；將小管細胞轉移至T25培養瓶或6cm培養皿，加入5ml左右*培養基混勻，放入培養箱過夜培養后查看細胞密度：若密度未超過80%，換液繼續培養，視情況傳代或者凍存。若密度超過80%，可直接進行傳代（方法同上）。

2、對于懸浮細胞，傳代可參考以下方法：

方法一：收集細胞，1000RPM條件下離心8-10分鐘，棄去上清液，補加1-2mL培養液后吹勻，將細胞懸液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培養基的新皿中或者瓶中。

方法二：可選擇半數換液方式，棄去半數培養基后，將剩余細胞懸起，將細胞懸液按1：2到1：3的比例分到新的含8ml培養基的新皿中或者瓶中。

3）細胞凍存：待細胞生長狀態良好時，可進行細胞凍存。貼壁細胞凍存時，棄去培養基后加入少量胰酶，細胞變圓脫落后，進行離心收集，1000RPM條件下離心8-10分鐘，去除上清，按凍存數量加入血清及DMSO，凍存比例為90%FBS+10%DMSO。

PS：若客戶收到2ml小管細胞，收到細胞后，用75%酒精噴灑整個管子消毒后放到超凈臺或安全柜內，嚴格無菌操作；將小管細胞轉移至T25培養瓶或6cm培養皿，加入5ml左右*培養基混勻，放入培養箱過夜培養后查看細胞密度：若密度未超過80%，換液繼續培養，視情況傳代或者凍存。若密度超過80%，可直接進行傳代（方法同上）。

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DLD-1-GFP人結直腸腺癌上皮細胞-綠色標記細胞 培養步驟

1.慢病毒包裝部分
1. 質粒共轉染細胞：轉染前一天，293T在10cm培養盤中的細胞達到90％，胰酶消化后，1：3傳入新10cm培養盤中。轉染時，細胞在培養盤中密度達到80％。采用脂質體PEI轉染法使編碼慢病毒包膜蛋白的質粒VSV G, Packaging Mix以及構建的Gluc或Mluc質粒15µg共轉染。6h后換新鮮DMEM培養基。
2．提取病毒上清：轉染48-72hours后，將含有病毒液的培養基轉移到15ml離心管中,在低溫4攝氏度條件下，3000rpm，離心10min去除片狀沉淀的細胞碎片。
3．濃縮病毒：將病毒上清用0.45um濾器過濾至濃縮離心管中，2000rpm，4℃，15min離心。濃縮液收集于500µl離心管中，-80℃保存。
1.慢病毒感染&篩選
1.感染前一天(Day1)，消化4T1細胞并計數，將細胞鋪于24孔板中（以便在感染前細胞達到30%-50%的匯合度，37°C過夜孵化細胞。
2.(Day2) 解凍低溫保存的慢病毒液，并且制備1：2病毒稀釋液200µl加入細胞中。
3.向每孔加入Polybrene達到終濃度6ug/ml，晃勻孔板，37度孵化過夜。
4.(Day3)移去含有慢病毒的培養基，加入500µl*培養基。
5.(Day4)換液，加入300µg/ml  Hygromycin（Sigma）來選擇穩定感染的細胞克隆。
6.(Day4－7），每24h換液，300µg/ml Hygromycin（Sigma）來選擇穩定感染的細胞克隆。
維持培養。
7.(Day8－12）細胞逐漸由24孔板傳入6孔板、6cm盤和10cm盤中100µg/ml Hygromycin維持培養。
8. 4T1-Gluc/Mluc細胞系鑒定: 取5×104細胞，用Passive Lysis裂解液裂解，加入熒光素酶作用底物，將轉染質粒的細胞與陰性，陽性對照共同進行單報告基因檢測。GFP和mCherry表達通過熒光顯微鏡觀察。
 
?培養條件 ：置于37℃、5％CO2培養箱中，用含10％胎牛血清（FBS;    Hyclone, Tauranga, New Zealand）和1％雙抗（100 U/ ml青霉素和100 μg/ ml鏈霉素，Hyclone, Logan, UT, USA）的高糖DMEM培養基培養，培養一天（密度大概80%）按照1：3的比例傳代。
?細胞傳代所需時間：1天/代 
?篩選標記維持壓力和選擇壓力：Hygromycin 100ug/ml 和300ug/ml 。
?體外實驗數據：
1.4T1-Gluc 和4T1-Mluc熒光顯微鏡照片(100×)：
2.細胞裂解液的發光值，數據—化學發光儀(Berthold Lumat LB 9501)檢測。