CHO-LUC中國倉鼠卵巢細胞-熒光素酶標記 培養步驟

慢病毒包裝部分
1. 質粒共轉染細胞：轉染前一天，293T在10cm培養盤中的細胞達到90％，胰酶消化后，1：3傳入新10cm培養盤中。轉染時，細胞在培養盤中密度達到80％。采用脂質體PEI轉染法使編碼慢病毒包膜蛋白的質粒VSV G, Packaging Mix以及構建的Gluc或Mluc質粒15µg共轉染。6h后換新鮮DMEM培養基。

2．提取病毒上清：轉染48-72hours后，將含有病毒液的培養基轉移到15ml離心管中,在低溫4攝氏度條件下，3000rpm，離心10min去除片狀沉淀的細胞碎片。

3．濃縮病毒：將病毒上清用0.45um濾器過濾至濃縮離心管中，2000rpm，4℃，15min離心。濃縮液收集于500µl離心管中，-80℃保存。

1.慢病毒感染&篩選
1.感染前一天(Day1)，消化4T1細胞并計數，將細胞鋪于24孔板中（以便在感染前細胞達到30%-50%的匯合度，37°C過夜孵化細胞。

2.(Day2) 解凍低溫保存的慢病毒液，并且制備1：2病毒稀釋液200µl加入細胞中。

3.向每孔加入Polybrene達到終濃度6ug/ml，晃勻孔板，37度孵化過夜。

4.(Day3)移去含有慢病毒的培養基，加入500µl*培養基。

5.(Day4)換液，加入300µg/ml  Hygromycin（Sigma）來選擇穩定感染的細胞克隆。

6.(Day4－7），每24h換液，300µg/ml Hygromycin（Sigma）來選擇穩定感染的細胞克隆。

維持培養。

7.(Day8－12）細胞逐漸由24孔板傳入6孔板、6cm盤和10cm盤中100µg/ml Hygromycin維持培養。

8. 4T1-Gluc/Mluc細胞系鑒定: 取5×104細胞，用Passive Lysis裂解液裂解，加入熒光素酶作用底物，將轉染質粒的細胞與陰性，陽性對照共同進行單報告基因檢測。GFP和mCherry表達通過熒光顯微鏡觀察。

•培養條件 ：置于37℃、5％CO2培養箱中，用含10％胎牛血清（FBS;    Hyclone, Tauranga, New Zealand）和1％雙抗（100 U/ ml青霉素和100 μg/ ml鏈霉素，Hyclone, Logan, UT, USA）的高糖DMEM培養基培養，培養一天（密度大概80%）按照1：3的比例傳代。
•細胞傳代所需時間：1天/代
•篩選標記維持壓力和選擇壓力：Hygromycin 100ug/ml 和300ug/ml 。
•體外實驗數據：
1.4T1-Gluc 和4T1-Mluc熒光顯微鏡照片(100×)：
2.細胞裂解液的發光值，數據—化學發光儀(Berthold Lumat LB 9501)檢測。

SNU４２３細胞保藏平臺；細胞生長特性：貼壁；細胞形態特性：詳見細胞說明書；細胞傳代方法：１：２-１：３傳代；每周換液２-３次。

KCL22S細胞;細胞背景資料：詳見相關文獻介紹;細胞傳代方法：１：２傳代;細胞生長特性：懸浮;細胞形態特性：詳見細胞說明書;相關細胞有：Stanford University-Diffuse Histiocytic Lymphoma-10細胞、SHG-44細胞、SK UT 1細胞

GM-3573細胞;細胞背景資料：這是P３X６３Ag８(ATCCTIB-９)的一個不分泌克隆。Kappa鏈合成了但不分泌。能抗０.１mM８-氮雜鳥嘌呤但不能在HAT培養基中生長。據報道它是由于缺失了３-酮類固醇還原酶活性的膽固醇營養缺陷型。檢測表明肢骨發育畸形病毒(鼠痘)陰性。;細胞傳代方法：１：２傳代，３天內可長滿。;細胞生長特性：懸浮生長;細胞形態特性：淋巴母細胞;相關細胞有：CCD18細胞、COLO-394細胞、CCRF-CEM C7細胞

CFPAC-1 Cells|人胰腺導管癌貼壁細胞

Okayama University Medical School-23細胞;細胞背景資料：詳見相關文獻介紹;細胞傳代方法：１：２-１：３傳代；每周換液２-３次。;細胞生長特性：貼壁或懸浮，詳見細胞說明書部分;細胞形態特性：詳見細胞說明書;相關細胞有：OC-316細胞、H-2108細胞、ELD-1細胞

RC-4B/C細胞;細胞背景資料：詳見相關文獻介紹;細胞傳代方法：１：２-１：３傳代；每周換液２-３次。;細胞生長特性：貼壁或懸浮，詳見細胞說明書部分;細胞形態特性：詳見細胞說明書;相關細胞有：SW-948細胞、BA/F3細胞、SK Mel28細胞

L5178YR細胞;細胞背景資料：詳見相關文獻介紹;細胞傳代方法：１：２-１：３傳代；每周換液２-３次。;細胞生長特性：貼壁或懸浮，詳見細胞說明書部分;細胞形態特性：詳見細胞說明書;相關細胞有：D10細胞、L M (TK-)細胞、NCIH748細胞

Z138細胞;細胞背景資料：詳見相關文獻介紹;細胞傳代方法：１：５-１：１５傳代；每周２-３次。;細胞生長特性：懸浮生長;細胞形態特性：淋巴母細胞;相關細胞有：NCI-H520細胞、HeLa 229細胞、KATOIII細胞

LS 1034細胞;細胞背景資料：詳見相關文獻介紹;細胞傳代方法：１：３傳代，每周２-３次;細胞生長特性：貼壁生長;細胞形態特性：上皮細胞樣;相關細胞有：MNNG-HOS (TE 85, clone F-5)細胞、LY細胞、OVCA 433細胞

3T3 Swiss Albino細胞;細胞背景資料：３T３細胞株是１９６２年Todaro G和Green H從分離的瑞士小鼠胚胎中建立的；該細胞的生長受接觸性抑制，匯合狀態的單層細胞密度為４００００個細胞/平方厘米；檢測結果顯示該細胞鼠痘病毒陰性；在中生長較好，在某些玻璃表面上可能狀態不佳；細胞生長飽和時其密度可以達到約５００００ cells/cm２。;細胞傳代方法：１：３傳代；３-４天１次。;細胞生長特性：貼壁生長;細胞形態特性：成纖維細胞樣;相關細胞有：OVTOKO細胞、BNL CL2細胞、CCK81細胞

COLO 699細胞;細胞背景資料：詳見相關文獻介紹;細胞傳代方法：１：２-１：３傳代；每周換液２-３次。;細胞生長特性：貼壁或懸浮，詳見細胞說明書部分;細胞形態特性：詳見細胞說明書;相關細胞有：TE671/RD細胞、UCD-MLA-144細胞、ZR-75-30細胞

CHG-5細胞;細胞背景資料：少突神經膠質瘤；男性;細胞傳代方法：１：２-１：３傳代；每周換液２-３次。;細胞生長特性：貼壁;細胞形態特性：詳見細胞說明書;相關細胞有：SW1573細胞、A375.S2細胞、CL 1-5細胞

BGC-８２３傳代細胞復蘇中心；細胞生長特性：貼壁生長；細胞形態特性：上皮樣；細胞傳代方法：１：３傳代，２-３天換液一次

BGC-８２３傳代細胞復蘇平臺；細胞生長特性：貼壁生長；細胞形態特性：上皮樣；細胞傳代方法：１：３傳代，２-３天換液一次

ML-２傳代細胞實驗中心；細胞生長特性：懸浮；細胞形態特性：詳見細胞說明書；細胞傳代方法：１：２-１：３傳代；每周換液２-３次。

Z１３８復蘇細胞；細胞生長特性：懸浮；細胞形態特性：詳見細胞說明書；細胞傳代方法：１：２-１：３傳代；每周換液２-３次。

MOPC凍存細胞；細胞生長特性：半貼壁；細胞形態特性：詳見細胞說明書；細胞傳代方法：１：２-１：３傳代；每周換液２-３次。

Lncap細胞實驗室；細胞生長特性：貼壁生長；細胞形態特性：上皮樣；梭形；細胞傳代方法：１：２傳代

LTEP-sm細胞實驗中心；細胞生長特性：貼壁；細胞形態特性：詳見細胞說明書；細胞傳代方法：１：２-１：３傳代；每周換液２-３次。

NCI-H４４６細胞實驗平臺；細胞生長特性：貼壁/懸浮生長，混合；細胞形態特性：上皮樣；細胞傳代方法：１：２傳代

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