B16F10-GFP小鼠黑色素瘤高轉移細胞-綠色標記 處理方法

購買國外細胞株需要考慮的因素有如下幾點：

1、細胞株的生物等級，由于有些細胞株及菌株屬于管制品，所以從國外購貨比較麻煩。

2、在購買國外細胞株時，需交待國外加比較多的干冰（一般在13公斤以上，采用比較密封的泡沫盒加套紙箱）。 B16F10-GFP細胞，上海琛藝實業有限公司細胞近3000種，來源于美國ATCC,細胞都是經過嚴格質量控制，在中國大陸努力搭建正牌細胞與國內廣大科研人員之間的溝通橋梁。B16F10細胞外，還有更多相關實驗產品，標準品，細胞株和實驗技術服務等等前期后續服務。

細胞培養中有哪些要注意的問題？又該如何解決呢？
1、培養液滲透壓是怎樣影響細胞生長的？
當細胞內、外環境的分子濃度不同時就會產生滲透壓。這種情況下，水分通過滲透流入或流出細胞，從而改變細胞的內環境。高滲透壓迫使水分從細胞中擴散出來導致細胞收縮，這種情況會使DNA和蛋白遭到破壞，細胞周期停滯以及zui終使細胞死亡；反之，低滲透壓使水分流入細胞內，使細胞腫脹破裂。
2、為什么有客戶要求培養基中不含酚紅？
研究表明，酚紅可以模擬固醇類激素的作用（特別是雌激素）。為避免固醇類反應，細胞培養，尤其是哺乳類細胞時，用不加酚紅的培養基。由于酚紅干擾檢測，一些研究人員在做流式細胞檢測時，不使用加酚紅的培養基。

購買上海琛藝細胞注意事項（然泰生物）發布
一、客戶收到細胞先不開蓋，放在培養箱靜置若干小時后（看細胞密度而定）在倒置顯微鏡下觀察細胞生長情況，并對細胞進行不同倍數拍照（建議受收細胞時的培養基拍一張照片，觀察培養基的顏色和是否有漏液情況，顯微鏡下拍細胞100X，200X各一張），排除細胞本身污染的情況；
收到細胞未開封，出現污染狀況我們負責免費發送一株細胞。
二、如為貼壁細胞，請在顯微鏡下觀察細胞密度：
1.  未超過80%匯合度時，用75%酒精（建議配置75%酒精的水也是滅菌超純水，噴灑整個瓶消毒后放到超菌臺內，嚴格無菌操作；然后打開蓋子，先用槍頭把培養基吸出10ml左右，放在離心管里，然后瓶口過火（嚴禁直接傾倒），這樣可以保證不污染，再用10ml的移液管，將剩余的培液全部吸出，放于離心管中，培養瓶中只剩余10ml左右培液就可以了。培養16hr(時間根據細胞生長情況調整）之后，傳代或者凍存。
2. 超過80%匯合度時，請按細胞培養條件傳代培養。具體步驟如下：
1) 棄去培養液，用3ml PBS（不含鈣，鎂離子）洗1-2次；
2) 加1ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM  EDTA）于T25培養瓶中，倒轉放于37度培養箱1-3分鐘預熱，然后又將培養瓶倒轉大約30秒后，在倒置顯微鏡下觀察細胞消化情況，若細胞大部分變圓分散，輕敲幾下培養培養瓶，細胞隨即脫落下來；
3) 加入6-8ml*培養基，吸出，分到新的培養瓶中，按要求分瓶。
三、如為懸浮細胞，吸出培養液，1000轉/分鐘離心5分鐘，吸出上清，管底細胞用新鮮培養基懸浮細胞后移回培養瓶。
注意：換液時一半用我們的培養基，一半用你們的，以免細胞不適應而造成生長不好。
四、細胞出現問題，可重發的情況有哪些？判定標準是什么？
（1）細胞運輸途中遭遇的各種問題，細胞丟失、破損、漏液等，重發；
（2）凍存的細胞復蘇后，絕大多數細胞未存活，重發；
（3）存活的細胞靜置24小時后，絕大多數細胞未存活，重發；
（4）凍存的細胞復蘇后或存活的細胞靜置4小時后并且未開封，出現污染，重發；
（5）視具體情況而定。
五、細胞出現問題，不予以重發的情況有哪些？
（1）客戶造成細胞污染，不重發；
（2）客戶不正確操作致細胞狀態不好，不重發；
（3）細胞狀態不好，未提供細胞培養前3天照片的，不重發；
（4）細胞培養時經其它處理的，不重發；
（5）細胞收到2天內，未告知，不重發；
（6）視具體情況而定。

細胞標記的步驟：

1. 慢病毒包裝部分

1. 質粒共轉染細胞：轉染前一天，293T在10cm培養盤中的細胞達到90％，胰酶消化后，1：3傳入新10cm培養盤中。轉染時，細胞在培養盤中密度達到80％。采用脂質體PEI轉染法使編碼慢病毒包膜蛋白的質粒VSV G, Packaging Mix以及構建的Gluc或Mluc質粒15µg共轉染。6h后換新鮮DMEM培養基。

2．提取病毒上清：轉染48-72hours后，將含有病毒液的培養基轉移到15ml離心管中,在低溫4攝氏度條件下，3000rpm，離心10min去除片狀沉淀的細胞碎片。

3．濃縮病毒：將病毒上清用0.45um濾器過濾至濃縮離心管中，2000rpm，4℃，15min離心。濃縮液收集于500µl離心管中，-80℃保存。

1. 慢病毒感染&篩選

1.感染前一天(Day1)，消化4T1細胞并計數，將細胞鋪于24孔板中（以便在感染前細胞達到30%-50%的匯合度，37°C過夜孵化細胞。

2.(Day2) 解凍低溫保存的慢病毒液，并且制備1：2病毒稀釋液200µl加入細胞中。

3.向每孔加入Polybrene達到終濃度6ug/ml，晃勻孔板，37度孵化過夜。

4.(Day3)移去含有慢病毒的培養基，加入500µl*培養基。

5.(Day4)換液，加入300µg/ml  Hygromycin（Sigma）來選擇穩定感染的細胞克隆。

6.(Day4－7），每24h換液，300µg/ml Hygromycin（Sigma）來選擇穩定感染的細胞克隆。

維持培養。

7.(Day8－12）細胞逐漸由24孔板傳入6孔板、6cm盤和10cm盤中100µg/ml Hygromycin維持培養。

8. B16F10-GFP小鼠黑色素瘤高轉移細胞細胞系鑒定: 取5×10⁴細胞，用Passive Lysis裂解液裂解，加入熒光素酶作用底物，將轉染質粒的細胞與陰性，陽性對照共同進行單報告基因檢測。GFP和mCherry表達通過熒光顯微鏡觀察。