A375-GFP人惡性黑色素瘤細(xì)胞-綠色標(biāo)記 培養(yǎng)步驟

產(chǎn)品名稱：A375-GFP細(xì)胞

中文名稱：A375-GFP人惡性黑色素瘤細(xì)胞

規(guī)格：T25

形態(tài)特征：A375源自一位54歲女性，是D.J.Giard等人建立的一系列細(xì)胞株中的一株。它在抗胸腺細(xì)胞球蛋白、血清處理的NIH 瑞士小鼠中形成類似于惡性黑素瘤的快速增長的皮下腫瘤，在普通成纖維細(xì)胞和瓊脂上形成克隆

生長狀態(tài)：上皮細(xì)胞樣

特征特性：貼壁生長

培養(yǎng)條件：DMEM（高糖）+10%FBS（推薦HAKATA優(yōu)等胎牛血清貨號：HN-FBS-500）

傳代方法：1:2傳代

支原體檢測：陰性

使用權(quán)限：A類

參考文獻：Amelogenin：X；CSF1PO：11，12；D13S317：11，14；D16S539：9；D18S51：12，17；D19S433：13，14.2；D21S11：29，30；D2S1338：16；D3S1358：15，17；D5S818：12；D7S820：9；D8S1179：11，14；FGA：23；TH01：8；TPOX：8，10；vWA：16，17；

供應(yīng)商：上海琛藝實業(yè)有限公司

復(fù)蘇周期：10個工作日左右

培養(yǎng)步驟：

1）復(fù)蘇細(xì)胞：將含有1mL細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入5mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000RPM條件下離心5分鐘，棄去上清液，補加4-6mL*培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜（或?qū)⒓?xì)胞懸液加入6cm皿中），培養(yǎng)過夜。第二天換液并檢查細(xì)胞密度。

2）細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達80%-90%，即可進行傳代培養(yǎng)。

1、對于貼壁細(xì)胞，傳代可參考以下方法：

1. 棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細(xì)胞1-2次。

2. 加1-2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2min，然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加5ml以上含10%血清的*培養(yǎng)基終止消化。

3.輕輕吹打細(xì)胞，*脫落后吸出，在1000RPM條件下離心8-10分鐘，棄去上清液，補加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻。

4. 按5-6ml/瓶補加培養(yǎng)液，將細(xì)胞懸液按1：2到1：5的比例分到新的含5-6 ml培養(yǎng)液的新皿中或者瓶中。

PS：若客戶收到2ml小管細(xì)胞，收到細(xì)胞后，用75%酒精噴灑整個管子消毒后放到超凈臺或安全柜內(nèi)，嚴(yán)格無菌操作；將小管細(xì)胞轉(zhuǎn)移至T25培養(yǎng)瓶或6cm培養(yǎng)皿，加入5ml左右*培養(yǎng)基混勻，放入培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)后查看細(xì)胞密度：若密度未超過80%，換液繼續(xù)培養(yǎng)，視情況傳代或者凍存。若密度超過80%，可直接進行傳代（方法同上）。

2、對于懸浮細(xì)胞，傳代可參考以下方法：

方法一：收集細(xì)胞，1000RPM條件下離心8-10分鐘，棄去上清液，補加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻，將細(xì)胞懸液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。

方法二：可選擇半數(shù)換液方式，棄去半數(shù)培養(yǎng)基后，將剩余細(xì)胞懸起，將細(xì)胞懸液按1：2到1：3的比例分到新的含8ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。

3）細(xì)胞凍存：待細(xì)胞生長狀態(tài)良好時，可進行細(xì)胞凍存。貼壁細(xì)胞凍存時，棄去培養(yǎng)基后加入少量胰酶，細(xì)胞變圓脫落后，進行離心收集，1000RPM條件下離心8-10分鐘，去除上清，按凍存數(shù)量加入血清及DMSO，凍存比例為90%FBS+10%DMSO。

PS：若客戶收到2ml小管細(xì)胞，收到細(xì)胞后，用75%酒精噴灑整個管子消毒后放到超凈臺或安全柜內(nèi)，嚴(yán)格無菌操作；將小管細(xì)胞轉(zhuǎn)移至T25培養(yǎng)瓶或6cm培養(yǎng)皿，加入5ml左右*培養(yǎng)基混勻，放入培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)后查看細(xì)胞密度：若密度未超過80%，換液繼續(xù)培養(yǎng)，視情況傳代或者凍存。若密度超過80%，可直接進行傳代（方法同上）。

上海琛藝實業(yè)是一家專業(yè)從事細(xì)胞培養(yǎng)相關(guān)產(chǎn)品的公司，擁有獨立細(xì)胞房（可隨時約定參觀），供應(yīng)胎牛血清，無血清細(xì)胞凍存液，無血清培養(yǎng)基，常規(guī)培養(yǎng)基，胰酶，雙抗，*培養(yǎng)基，STR鑒定細(xì)胞，感受態(tài)細(xì)胞等，專業(yè)，專注，性價比高，是您Shou選之家。
1.慢病毒包裝部分
1. 質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細(xì)胞：轉(zhuǎn)染前一天，293T在10cm培養(yǎng)盤中的細(xì)胞達到90％，胰酶消化后，1：3傳入新10cm培養(yǎng)盤中。轉(zhuǎn)染時，細(xì)胞在培養(yǎng)盤中密度達到80％。采用脂質(zhì)體PEI轉(zhuǎn)染法使編碼慢病毒包膜蛋白的質(zhì)粒VSV G, Packaging Mix以及構(gòu)建的Gluc或Mluc質(zhì)粒15µg共轉(zhuǎn)染。6h后換新鮮DMEM培養(yǎng)基。
2．提取病毒上清：轉(zhuǎn)染48-72hours后，將含有病毒液的培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移到15ml離心管中,在低溫4攝氏度條件下，3000rpm，離心10min去除片狀沉淀的細(xì)胞碎片。
3．濃縮病毒：將病毒上清用0.45um濾器過濾至濃縮離心管中，2000rpm，4℃，15min離心。濃縮液收集于500µl離心管中，-80℃保存。
1.慢病毒感染&篩選
1.感染前一天(Day1)，消化4T1細(xì)胞并計數(shù)，將細(xì)胞鋪于24孔板中（以便在感染前細(xì)胞達到30%-50%的匯合度，37°C過夜孵化細(xì)胞。
2.(Day2) 解凍低溫保存的慢病毒液，并且制備1：2病毒稀釋液200µl加入細(xì)胞中。
3.向每孔加入Polybrene達到終濃度6ug/ml，晃勻孔板，37度孵化過夜。
4.(Day3)移去含有慢病毒的培養(yǎng)基，加入500µl*培養(yǎng)基。
5.(Day4)換液，加入300µg/ml  Hygromycin（Sigma）來選擇穩(wěn)定感染的細(xì)胞克隆。
6.(Day4－7），每24h換液，300µg/ml Hygromycin（Sigma）來選擇穩(wěn)定感染的細(xì)胞克隆。
維持培養(yǎng)。
7.(Day8－12）細(xì)胞逐漸由24孔板傳入6孔板、6cm盤和10cm盤中100µg/ml Hygromycin維持培養(yǎng)。
8. 4T1-Gluc/Mluc細(xì)胞系鑒定: 取5×104細(xì)胞，用Passive Lysis裂解液裂解，加入熒光素酶作用底物，將轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的細(xì)胞與陰性，陽性對照共同進行單報告基因檢測。GFP和mCherry表達通過熒光顯微鏡觀察。
 
?培養(yǎng)條件 ：置于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中，用含10％胎牛血清（FBS;    Hyclone, Tauranga, New Zealand）和1％雙抗（100 U/ ml青霉素和100 μg/ ml鏈霉素，Hyclone, Logan, UT, USA）的高糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)一天（密度大概80%）按照1：3的比例傳代。
?細(xì)胞傳代所需時間：1天/代 
?篩選標(biāo)記維持壓力和選擇壓力：Hygromycin 100ug/ml 和300ug/ml 。
?體外實驗數(shù)據(jù)：
1.4T1-Gluc 和4T1-Mluc熒光顯微鏡照片(100×)：
2.細(xì)胞裂解液的發(fā)光值，數(shù)據(jù)—化學(xué)發(fā)光儀(Berthold Lumat LB 9501)檢測。