人白介素-33(IL-33)ELISA試劑盒

(用于血清、血漿、細胞培養上清液和其它生物體液內)

原理

本實驗采用雙抗體夾心ABC-ELISA法。用抗人IL-33單抗包被于酶標板上，標準品和樣品中的IL-33與單抗結合，加入生物素化的抗人IL-33，形成免疫復合物連接在板上，辣根過氧化物酶標記的Streptavidin與生物素結合，加入底物工作液顯藍色，后加終止液硫酸，在450nm處測OD值，IL-33濃度與OD值成正比，可通過繪制標準曲線求出標本中IL-33濃度。

試劑盒組成（2-8℃保存）

酶標板（CoatedWells）

96孔

酶標抗體工作液（EnzymeConjugate）

12ml

10×標本稀釋液（SampleBuffer）

12ml

20×濃縮洗滌液（WashBuffer）

50ml

標準品（Standards）：20ng/瓶

2瓶

底物工作液（TMBSolution）

12ml

di一抗體工作液（BiotinylatedAntibody）

12ml

終止液（StopSolution）

12ml

準備試劑與收集血樣

1.收集標本：血清、血漿（EDTA、檸檬酸鹽、肝素抗凝）、細胞培養上清液、組織勻漿等盡早檢測，2-8℃保存48小時；更長時間須冷凍（-20℃或-70℃）保存，避免反復凍融。

2.標準品液配制：使用前加入1ml蒸餾水混勻，配成20ng/ml的溶液。設標準管8管，di一管加標本稀釋液900ul，第二至第八管加入標本稀釋液500ul。在di一管中加入20ng/ml的標準品溶液100ul混勻后用加樣器吸出500ul，移至第二管。如此反復作對倍稀釋，從第七管中吸出500ul棄去。第八管為空白對照。

3.10×標本稀釋液用蒸餾水作1:10倍稀釋（示例：1ml濃稀釋液+9ml蒸餾水）。

4.洗滌液：用重蒸水1:20稀釋（示例：1ml濃縮洗滌液加入19ml的重蒸水）

檢測程序

1.加樣：每孔各加入標準品或待測樣品100ul，將反應板充分混勻后置37℃120分鐘。

2.洗板：用洗滌液將反應板充分洗滌4-6次，向濾紙上印干。

3.每孔中加入di一抗體工作液100ul。將反應板充分混勻后置37℃60分鐘。

4.洗板：同前。

5.每孔加酶標抗體工作液100ul。將反應板置37℃30分鐘。

6.洗板：同前。

7.每孔加入底物工作液100ul，置37℃暗處反應15分鐘。

8.每孔加入100ul終止液混勻。

9.30分鐘內用酶標儀在450nm處測吸光值。

人白介素-33(IL-33)ELISA試劑盒采用雙抗體夾心ELISA法定量測定人血清、血漿、組織勻漿、細胞裂解液、細胞培養上清液和其他生物液體含量。
液體類標本：
包括血清，血漿，尿液，胸腹水，腦脊液，細胞培養上清液等。
血清：
室溫血液自然凝固10-20分鐘后，離心20分鐘左右（2000-3000轉/分），仔細收集上清，如保存過程中如有沉淀，請再次離心。
血漿：
應根據標本的要求選擇EDTA，檸檬酸鈉或者肝素作為抗凝劑，混合10-20分鐘后，在離心20分鐘（2000-3000轉/分），仔細收集上清，如保存過程中有沉淀，請再次離心。
尿液：
用無菌管收集，離心20分鐘左右（2000-3000轉/分），仔細收集上清，如保存過程中有沉淀，請再次離心。
細胞培養上清：
檢測分泌性的成份時，用無菌管收集，離心20分鐘左右（2000-3000轉/分），仔細收集上清。檢測細胞內的成份時，用PBS（PH7.2-7.4）稀釋細胞懸液，當細胞濃度達到100萬/ml左右，通過反復凍融，使細胞破壞并釋放細胞內的成份，離心20分鐘左右（2000-3000轉/分），仔細收集上清，如保存過程中有沉淀，請再次離心。
組織標本：
切割標本后，稱取重量，加入一定量的PBS（PH7.4），用液氮迅速冷凍保存備用，標本融化后仍保持2-8℃的溫度，加入一定量的PBS（PH7.4），用手工或勻漿器將標本勻漿充分，離心20分鐘左右（2000-3000轉/分），仔細收集上清，分裝后留一份待檢測，其余冷凍備用。

結果計算與判斷

1.所有OD值都應減除空白值后再行計算。

2.以標準品2000、1000、500、250、125、62.5、31.2、0pg/ml為橫坐標，OD值為縱坐標，在坐標紙上作圖，畫出標準曲線。

3.根據樣品OD值在該曲線圖上查出相應IL-33含量。

試劑盒性能

1.靈敏度：小的IL-33檢測濃度小于15pg/ml。

2.特異性：可同時檢測重組或天然的人IL-33。不與人其它細胞因子有交叉反應。

3.重復性：板內、板見變異系數均小于10％。

注意事項

1.以上標準孔及待測樣品均建議做復孔，每次測定應同時做標準曲線。

2.洗滌過程很關鍵。洗滌不充分將導致精確度誤差及OD值錯誤地升高。

3.板條開封后剩余板條要再封好，保持板條干燥。

4.本試劑盒宜置4oC冰箱保存。

5.本試劑盒僅用于科研，不能用于臨床診斷！