細胞氧化應激活性氧羥自由基比色法定量檢測試劑盒產品說明書（中文版）

主要用途

 細胞氧化應激活性氧羥自由基比色法定量檢測試劑是一種旨在通過捕獲劑二甲基亞砜，受到羥自由基的氧化，進而與偶氮染料反應，產生黃色產物，由分光光度儀比色分析，來定量檢測細胞內羥自由基活性氧族的生成和增加的*而經典的技術方法。該技術經過精心研制、成功實驗證明的。適用于各種細胞（動物、人體等）裂解懸液或培養上清的羥自由基檢測，以及羥自由基激發劑和抗氧化清除劑（scanvenger）等的檢測。可以被用于細胞凋亡、信號傳遞、衰老、代謝和營養學等的研究。產品嚴格無菌，即到即用，操作簡捷，性能穩定，顯色清晰。

技術背景

超氧自由基陰離子（superoxide radical；O^2-）、過氧化氫（hydrogen peroxide；H₂O₂）、羥自由基或氫氧基（hydroxyl radical；OH^-）、過氧化基（peroxyl radical；ROO^-）、氫過氧自由基（hydroperoxyl；HOO）、烷氧自由基（alcoxyl radical）、氮氧基（nitric Oxide；NO^-）、過氧亞硝基陰離子（peroxynitrite anion；ONOO^-）次氯酸（hypochlorous acid；HClO）、半醌自由基（semiquinone radical）、單線態氧氣（singlet oxygen）等細胞內活性氧族（Reactive Oxygen Species；ROS）的產生和增多，將導致細胞衰老或凋亡。其中羥自由基或氫氧基具有極度反應性和毒性，同時半衰期短（10^－9至10^－10秒）。其產生主要是水分子受到高能量放射后裂解、過氧化物和次氯酸反應、過氧化氫的還原、超氧化物的歧化等形成。使用二甲基亞砜（dimethy sulfoxide；DMSO），作為羥自由基的分子探針，捕獲羥自由基，并被氧化為甲基亞磺酸（methane sulfinic acid；MSA），在偶氮染料（diazonium dye）的作用下，產生黃色產物偶氮亞砜（diazosulfone），通過分光光度儀（420nm波長）檢測，以測定羥自由基的含量。據此證明細胞內活性氧族的存在。其反應系統為：

DMSO  +  OH^-       →      MSA  +  CH3

MSA  +  diazonium dye       →      diazosulfone  +  H^＋

產品內容

 清理液（Reagent A）    200毫升

 標記液（Reagent B）    300微升

 酸性液（Reagent C）      1毫升

 染色液（Reagent D）      5瓶

 凈化液（Reagent E）     30毫升

 終止液（Reagent F）     50毫升

 萃取液（Reagent G）     30毫升

 穩定液（Reagent H）    2.5毫升

 標準液（Reagent I）      2毫升

產品說明書 1份

保存方式

保存 染色液（Reagent D）和 標準液（Reagent I）在－20℃冰箱里，避免光照；其余的保存在4℃冰箱里； 酸性液（Reagent C）和 凈化液（Reagent E）具有腐蝕性，注意操作安全； 凈化液（Reagent E）、 終止液（Reagent F）、 萃取液（Reagent G）和 穩定液（Reagent H）容易揮發，注意密閉；有效保證6月

用戶自備

1.5毫升離心管：用于樣品和標準液操作的容器

2.2毫升離心管：用于樣品操作的容器

5毫升玻璃管：用于樣品操作的容器

15毫升錐形離心管：用于樣品操作的容器

細胞刮脫棒：用于貼壁細胞脫離

DOUNCE勻漿器：用于細胞裂解

（微型）臺式離心機：用于樣品操作

1毫升1厘米光徑石英或玻璃比色皿：用于比色分析的容器

分光光度儀：用于比色分析

實驗步驟

一、樣品準備

選擇一：培養細胞

• 準備好25cm²細胞培養瓶或60mm細胞培養皿的待測培養細胞（1至5 X 10⁶細胞）
• 小心抽去培養液
• 小心加入3毫升 清理液（Reagent A），覆蓋生長表面
• 小心抽去清理液
• 使用細胞刮脫棒輕柔刮脫細胞（注意：避免使用胰酶消化）
• 加入3毫升 清理液（Reagent A），混勻細胞
• 移入到預冷的15毫升錐形離心管（注意：懸浮細胞從這一步驟開始）
• 放進4℃臺式離心機離心5分鐘，速度為300g
• 小心抽去上清液
• 加入1毫升 清理液（Reagent A）
• 強力渦旋震蕩15秒
• 即刻放入預冷的DOUNCE勻漿器
• 在冰槽里用研磨棒勻化細胞（約80下）
• 將所有細胞勻漿物移入1.5毫升離心管
• 放進4℃微型臺式離心機離心5分鐘，速度為10000g
• 小心移取1毫升上清液到新的預冷的15毫升錐形離心管
• 移取10微升進行蛋白定量檢測（注意：建議使用  Bradford蛋白質濃度定量試劑盒－GMS30030.1）
• 即刻放進－70℃保存或置于冰槽里繼續后續操作

選擇二：細胞培養液

• 移取1毫升細胞培養液到1.5毫升離心管
• 放進微型臺式離心機離心5分鐘，速度為10000g
• 小心移取1毫升上清液到新的預冷的1.5毫升離心管
• 即刻放進－70℃保存或置于冰槽里繼續后續操作

二、標準樣品配制

• 準備好5個1.5毫升離心管，標記為1至5號管
• 分別加入450微升 清理液（Reagent A）到2至5號管
• 移取900微升 標準液（Reagent I）到1號管
• 小心移取450微升1號管的 標準液（Reagent I）到2號管，混勻
• 小心移取450微升2號管稀釋的 標準液（Reagent I）到3號管，混勻
• 小心移取450微升3號管稀釋的 標準液（Reagent I）到4號管，混勻
• 將1至5號管放進冰槽里備用，避免光照；標準管濃度見下表

• 標準曲線測定

實驗開始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的 染色液（Reagent D）置入室溫下，然后移出5毫升 清理液（Reagent A）到 染色液（Reagent D）瓶里，混勻后，加入5毫升 凈化液（Reagent E），混勻后，移取5毫升上層液相到新的10毫升瓶里（注意：使用PE或玻璃瓶），標記為 染色工作液，使用錫箔紙包裹避光，置于冰槽里備用（注意：可以使用6次）。 然后進行下列操作

• 移取400微升上述配制的 標準液（Reagent I）到5毫升玻璃管
• 加入40微升 酸性液（Reagent C）
• 加入800微升 染色工作液，混勻
• 室溫下孵育10分鐘，避免光照
• 加入1.2毫升 終止液（Reagent F）
• 渦旋震蕩1秒
• 靜置分層
• 移取1毫升上層液相到新的2.2毫升離心管
• 加入1毫升 萃取液（Reagent G）
• 渦旋震蕩1秒
• 靜置分層
• 移取1毫升上層液相到到新的比色皿
• 加入100微升 穩定液（Reagent H）
• 上下傾倒混勻
• 即刻放進分光光度儀（420nm波長）檢測：獲得吸光讀數
• 重復實驗步驟1至15四次
• 構建標準曲線：縱座標（Y軸）為吸光讀數；橫座標（X軸）為標準MSA濃度（微摩爾/升）

• 樣品測定

• 移取400微升待測樣品到5毫升玻璃管
• 加入12微升 標記液（Reagent B）
• 渦旋震蕩5秒
• 室溫下孵育30分鐘
• 加入40微升 酸性液（Reagent C）
• 加入800微升 染色工作液，混勻
• 室溫下孵育10分鐘，避免光照
• 加入1.2毫升 終止液（Reagent F）
• 渦旋振蕩1秒
• 靜置分層
• 移取1毫升上層液相到新的2.2毫升離心管
• 加入1毫升 萃取液（Reagent G）
• 渦旋震蕩1秒
• 靜置分層
• 移取1毫升上層液相到到新的比色皿
• 加入100微升 穩定液（Reagent H）
• 上下傾倒混勻
• 即刻放進分光光度儀（420nm波長）檢測：獲得吸光讀數
• 根據標準曲線獲得樣品對應MSA濃度，即羥自由基濃度（微摩爾/升）
• 計算樣品實際MSA濃度，即羥自由基濃度（微摩爾/升）

【根據標準曲線獲得樣品對應MSA濃度（微摩爾/升）X 1.2（體系容量；毫升）X 樣品稀釋倍數】÷0.4（樣品容量；毫升）

• 或構建細胞內活性氧生成曲線：縱座標（Y軸）為羥自由基活性氧吸光值（OD）；橫坐標（X軸）為細胞量、蛋白量、時間點或藥物處理濃度等

注意事項

• 本產品為20次操作
• 操作時，須戴手套
•  酸性液（Reagent C）和 凈化液（Reagent E）具有腐蝕性，注意操作安全
•  凈化液（Reagent E）、 終止液（Reagent F）和 萃取液（Reagent G）和 穩定液（Reagent H）容易揮發，注意密閉
• 建議 染色工作液現配現用為佳
• 孵育時，避免光照
• 建議使用新鮮樣品
• 建議使用1毫升1厘米光徑石英或玻璃比色皿
• 本產品適合抗氧化能力檢測
• 用戶可以使用410至420nm之間的任一波長進行檢測
• 本公司提供系列氧化應急活性氧檢測試劑產品

質量標準

• 本產品經鑒定性能穩定
• 本產品經鑒定檢測敏感