143B/LUC細胞| 人骨肉瘤細胞帶熒光素酶培養步驟及其保種心得：
首先，細胞采購的運輸形式一般分為兩種，一種是直接寄送凍存細胞，一種是復蘇后寄送活細胞。前者是由液氮中取出細胞凍存管，采用干冰運輸；后者是將細胞復蘇至T-25培養瓶中，采用常溫運輸。兩者各有優缺點，di一種方式的優點是可以長途運輸，因為細胞在干冰中相對穩定，一般可以保證數周之內不影響細胞活性，但缺點是運輸成本高，且細胞復蘇是很復雜的過程，如果細胞復蘇后狀態不佳，則很難界定是來源的問題還是復蘇操作的問題；而第二種方式的優點是細胞收到后可以直接通過觀察來大體了解細胞狀態，并且對運輸的要求相對較低，缺點則是只適合短途運輸，因為即便運輸時培養基中不添加血清，細胞還是會不斷增殖，當細胞長滿后，細胞的狀態會隨時間的增加而不斷變差。綜上，如果是從國外大型細胞庫采購，一般采用di一種方法，既能適應長途運輸，且大型細胞庫的凍存細胞質量普遍較好，在良好的操作下復蘇成活率很高；如果是從國內細胞庫采購，則一般采用第二種方法，方便收到細胞時能較好掌握細胞狀態，并且降低運輸成本。
細胞分別針對兩種運輸方式來談下對新細胞的處理過程：
對于直接寄送凍存細胞的情況，首先要檢查的就是細胞收到后是否有足量剩余干冰，如果干冰不足，或是已經沒有干冰，則細胞狀態可能會收到影響，建議盡快復蘇；如果有足量干冰，建議先轉移至-80℃冰箱過夜，于第二天按正常流程復蘇，即37℃水浴鍋中快速融解，低速離心后去除含DMSO的凍存液，換入適合細胞的新鮮培養基，輕柔吹勻后轉移至培養皿中，補足培養基；一般貼壁細胞在24h內即可觀察到細胞貼壁，從而判斷細胞狀態，懸浮細胞則復蘇后即可觀察細胞狀態。對于凍存時間較長的細胞，可能需要傳代1到2次后，細胞才會調整到正常狀態，所以細胞復蘇后如果狀態不佳，不要灰心，仍要細心培養。
對于復蘇后寄送活細胞的情況，則細胞收到后要先檢查細胞瓶是否有破損，細胞瓶在運輸中很有可能受到碰撞和擠壓，導致瓶體受損。如果發現細胞瓶受損，則需要盡快處理，該棄就棄。如果細胞瓶完好，則用酒精消毒瓶身，去除封口膜，然后置于37℃培養箱中靜置1-2h。待細胞穩定后，觀察細胞狀態，并及時記錄，因為很多國內細胞庫都是可以反饋細胞狀態的，如果收到時細胞狀態不佳甚至污染，是可以要求重新寄送的。細胞如沒有異常，則盡快傳代并更換適合細胞的新鮮培養基。由于新細胞一般都是di一次接觸，細胞傳代過程中尤為需要注意胰酶消化時間，消化時間過短或過長都會影響細胞狀態，甚至導致細胞死亡。我建議大家采用低濃度胰酶消化，消化時縮短放培養箱和觀察的間隔時間，以便盡可能找到合適的消化時間。
一、實驗前準備工作：
1、培養瓶的包被：包被液如多聚賴氨酸（PLL，ScienCell品牌）或纖維粘連蛋白（BPF，ScienCell品牌），以無菌水稀釋至2 ug/cm2的濃度包被培養瓶。37度孵箱1小時或4度過夜，從包被好的培養瓶中回收多聚賴氨酸，并用無菌水洗滌培養瓶2遍。包被好的培養瓶不要放置超過24小時，其中的包被液可吸出重復使用2-3次，注意不要污染。
2、*培養基的配置：以內皮細胞培養基（ECM，ScienCell品牌）為例，把配套的胎牛血清（FBS，ScienCell品牌）、生長因子（ECGS，ScienCell品牌）和雙抗（P/S，ScienCell品牌）加入基礎培養液（ECM，ScienCell品牌）中。重新貼好標簽，并混勻培養基。
二、原代細胞復蘇方法：
1、從液氮中取出原代細胞冷凍管，迅速投入37～38 ℃水浴中，其間可以輕輕轉動細胞，加快融化速度，大約需要1分鐘時間。
2、5分鐘內用培養基稀釋至原體積的10倍以上，加入培養瓶中，再用1ml培養基洗滌細胞凍存管，保證細胞都被加入培養瓶中，靜置于孵箱，12-16小時后更換培養基（除去DMSO）。以后每2天換一次液，保證細胞狀態良好。
三、原代細胞傳代方法：酶消化法
當細胞生長至70-80%左右可以傳代，傳代比例以1:2或1:3為佳。具體方法如下：
1、棄去培養瓶中培養基，用PBS洗滌培養瓶2遍，加入0.25%的胰酶消化液（Trypsin-EDTA，ScienCell品牌，貨號0103），以消化液能覆蓋整個瓶底為準。37度孵育4分鐘左右，輕拍培養瓶側面，顯微鏡下觀察細胞消化情況，直到80%細胞呈現圓形。
2、細胞消化好后，加入胰酶中和液（TNS，ScienCell品牌，貨號0113），并輕輕搖動培養瓶，形成細胞懸液，然后將細胞和培養基轉移至離心管中，1000rpm離心5分鐘。
3、棄去上清液，以1-2ml新鮮培養基重新懸浮細胞并吹打均勻，接種于包被好的新培養瓶中，瓶中已有10ml左右的培養基，放入培養箱中培養，每2天更換培養基。

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