大腸桿菌類感受態(tài)細(xì)胞XL2-Blue操作說明書

操作步驟 （以下操作均按無菌條件的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行）

1. 取感受態(tài)細(xì)胞置于冰浴中，如需分裝可將剛?cè)诨?xì)胞 懸液分裝到無菌預(yù)冷的離心管中，置于冰浴中。 注意： 一次轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞的建議用量為50-100 μl， 可以根據(jù)實(shí)際情況分裝使用。應(yīng)注意所用DNA體積不 要超過感受態(tài)細(xì)胞懸液體積的十分之一。以下實(shí)驗(yàn)以 100 μl感受態(tài)細(xì)胞為例。

2. 向感受態(tài)細(xì)胞懸液中加入目的DNA（100 μl的感受態(tài) 細(xì)胞能夠被1 ng超螺旋質(zhì)粒DNA所飽和)，輕彈混勻， 在冰浴中靜置30 min。

3. 將離心管置于42℃水浴中放置60-90 sec，然后快速將 管轉(zhuǎn)移到冰浴中，使細(xì)胞冷卻2-3 min，該過程不要搖 動(dòng)離心管。 注意：此步驟也可將離心管置于室溫進(jìn)行，時(shí)間不需 十分準(zhǔn)確，夏季或室溫較高時(shí)，可放置5-8 min左右， 如果室溫較低，可延長時(shí)間至8-15 min左右。條件允 許建議使用42℃熱激方法。

4. 向每個(gè)離心管中加入900 μl 無菌的SOC或LB培養(yǎng)基 （不含抗生素）， 混勻后置于37℃搖床振蕩培養(yǎng)45 min (150 rpm)，目的是使質(zhì)粒上相關(guān)的抗性標(biāo)記基因 表達(dá)，使菌體復(fù)蘇。

5. 將離心管內(nèi)容物混勻，吸取100 μl已轉(zhuǎn)化的感受 態(tài)細(xì)胞加到含相應(yīng)抗生素的SOB或LB固體瓊脂 培養(yǎng)基上，用無菌的彎頭玻棒輕輕的將細(xì)胞均勻 涂開。將平板置于室溫直至液體被吸收，倒置平 板，37℃培養(yǎng)12-16 h。 注意：涂布用量可根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)來調(diào)整。如轉(zhuǎn)化 的DNA總量較多，可取更少量轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布平 板；反之，如轉(zhuǎn)化的DNA總量較少，可取200- 300 μl轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布平板。如果預(yù)計(jì)的克隆較 少，可通過離心（4000 rpm, 2 min）后吸除部 分培養(yǎng)液，懸浮菌體后將其涂布于一個(gè)平板中。 （涂布剩余的菌液可置于4℃保存，如果次日的轉(zhuǎn) 化菌落數(shù)過少可以將剩下的菌液再涂布新的培養(yǎng) 板）

注意事項(xiàng)：  
 1、感受態(tài)細(xì)胞應(yīng)保存在-70 ℃，不可反復(fù)凍融，否則其轉(zhuǎn)化效率將會(huì)降低。  
 2、實(shí)驗(yàn)過程中應(yīng)嚴(yán)格無菌操作，防止其它 DNA的污染，避免為以后的篩選、鑒定帶來影響。  
 3、轉(zhuǎn)化時(shí)，轉(zhuǎn)化效率與外源 DNA的濃度在一定范圍內(nèi)成正比，但當(dāng)加入的外源DNA量過多或體積過大反而會(huì)降低轉(zhuǎn)化效率。轉(zhuǎn)化時(shí)DNA體積要小于感受態(tài)細(xì)胞體積的十分之一。  
 4、轉(zhuǎn)化率的計(jì)算：轉(zhuǎn)化率＝產(chǎn)生菌落的總數(shù)/ 鋪板DNA總量。  
 5、為防止轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)不成功，可以保留部分連接產(chǎn)物，以重新轉(zhuǎn)化，將損失降到低