人纖維母細胞表面抗原(FSP)ELISA試劑盒相關實驗研究：

CCL21/CCR7信號途徑與移植腎纖維化關系的研究
摘要：通過免疫組織化學和免疫熒光雙重染色的方法,觀察CCL21和CCR7在移植腎穿刺活檢組織中的表達情況,同時觀察纖維母細胞的標記物FSP和S100A4在移植腎穿刺組織中的分布,選擇纖維母細胞的*標示物,此外,結合臨床資料分析腎移植病人臨床預后與FSP、CCL21和CCR7表達的關系,初步探索纖維母細胞和CCL21/CCR7信號通路與移植腎纖維化的關系。方法:收集吉林大學腎移植中心現有的腎臟穿刺標本78例,常規HE染色、PAS染色和MASSOM染色后進行病理診斷,而后對各階段移植腎穿刺活檢病例進行纖維母細胞表面抗原FSP,纖維母細胞特異抗原S100A4,趨化因子CCL21和其受體CCR7的免疫組織化學染色,觀察各抗體的分布及表達;再利用CCL21分別和FSP、CCR7進行免疫熒光雙重染色,在共聚焦顯微鏡下觀察定位它們的表達情況,探討CCL21/CCR7信號通路與移植腎纖維化的關系,并結合臨床資料分析纖維母細胞和CCL21/CCR7信號通路與病人的臨床發展聯系。結果:FSP、S100A4、CCR7、CCL21均在移植腎活檢組織中存在陽性表達。
試劑盒的組成： 
（1）結合物及標本的稀釋液；
（2）洗滌液，在板式ELISA中，常用的稀釋液為含0.05%吐溫20磷酸緩沖鹽水；
（3）酶標記的抗原或抗體（結合物）；
（4）酶的底物；
（5）陰性對照品和陽性對照品（定性測定中），elisa試劑盒參考標準品和控制血清（定量測定中）；
（6）已包被抗原或抗體的固相載體（免疫吸附劑）
用途：科研與實驗試劑，不得用于臨床診斷。
檢測種屬：人、大小鼠、兔、羊、猴、豬、豚鼠ELISA檢測試劑盒等種屬。
標本：血清、血漿、細胞上清液、尿液、體液、灌洗液、腦脊髓、心房水、胸房水、組織等。 

人纖維母細胞表面抗原(FSP)ELISA試劑盒雙抗體夾心ELISA法定量測定人血清、血漿、組織勻漿、細胞裂解液、細胞培養上清液和其他生物液體含量。

液體類標本：
包括血清，血漿，尿液，胸腹水，腦脊液，細胞培養上清液等。
血清：
室溫血液自然凝固10-20分鐘后，離心20分鐘左右（2000-3000轉/分），仔細收集上清，如保存過程中如有沉淀，請再次離心。
血漿：
應根據標本的要求選擇EDTA，檸檬酸鈉或者肝素作為抗凝劑，混合10-20分鐘后，在離心20分鐘（2000-3000轉/分），仔細收集上清，如保存過程中有沉淀，請再次離心。
尿液：
用無菌管收集，離心20分鐘左右（2000-3000轉/分），仔細收集上清，如保存過程中有沉淀，請再次離心。
細胞培養上清：
檢測分泌性的成份時，用無菌管收集，離心20分鐘左右（2000-3000轉/分），仔細收集上清。檢測細胞內的成份時，用PBS（PH7.2-7.4）稀釋細胞懸液，當細胞濃度達到100萬/ml左右，通過反復凍融，使細胞破壞并釋放細胞內的成份，離心20分鐘左右（2000-3000轉/分），仔細收集上清，如保存過程中有沉淀，請再次離心。
組織標本：
切割標本后，稱取重量，加入一定量的PBS（PH7.4），用液氮迅速冷凍保存備用，標本融化后仍保持2-8℃的溫度，加入一定量的PBS（PH7.4），用手工或勻漿器將標本勻漿充分，離心20分鐘左右（2000-3000轉/分），仔細收集上清，分裝后留一份待檢測，其余冷凍備用。

 ELISA試劑盒代理，臨床ELISA測定中可能會出現的問題及可能的原因
問 題 可能的原因（非試劑盒本身的原因）
1．弱陽性質控樣本檢測不出 溫育的時間或溫度不夠；顯色反應時間太短；所用配制緩沖液的蒸餾水有問題
2．測定的重復性差 （相同樣本兩次測定結果不一致） 這是典型的由測定操作引起的問題，包括
（1）加樣本及試劑量不準；孔間不一致；
（2）加樣過快，孔間發生污染；
（3）加錯樣本；
（4）加樣本及試劑時，加在孔壁上部非包被區；
（5）不同批號試劑盒中組分混用；
（6）溫育時間、洗板、顯色時間不一致；
（7）孔內污染雜物；
（8）酶標儀濾光片不正確；
（9）血清標本未*凝固即加入，反應孔內出現纖維蛋白凝固或殘留血細胞，易出現假陽性反應等。
3．白板
（陽性對照不顯色） （1）漏加酶結合物；
（2）洗板液配制中出現問題，如量筒不干凈，含酶抑制物（如疊氮鈉）等。
（3）漏加顯色劑A或B；
（4）終止劑當顯色劑使用。
4．全部板孔均有顯色 （1）洗板不干凈；
（2）顯色液變質；
（3）加底物的吸光受酶污染；
（4）洗板液受酶等污染。 

ELISA試劑盒的包被條件與封閉：包被用抗原或抗體的濃度，包被的溫度和時間，包被液的pH等應根據試驗的特點和材料的性質而選定。抗體和蛋白質抗原一般采用pH9.6的碳酸鹽緩沖液作為稀釋液，也有用pH7.2的磷酸鹽緩沖液及pH7~8的Tris-HCL緩沖液作為稀釋液的。通常在ELISA板孔中加入包被液后，在4-8℃冰箱中放置過夜，37℃中保溫2小時被認為具有同等的包被效果。包被的zui適當濃度隨載體和。抗體和蛋白質抗原一般采用pH9.6的碳酸鹽緩沖液作為稀釋液，也有用pH7.2的磷酸鹽緩沖液及pH7~8的Tris-HCL緩沖液作為稀釋液的。通常在ELISA板孔中加入包被液后，在4-8℃冰箱中放置過夜，37℃中保溫2小時被認為具有同等的包被效果。包被的zui適當濃度隨載體和包被物的性質可有很大的變化，每批材料需通過實驗與酶結合物的濃度協調選定。一般蛋白質的包被濃度為100ng/ml-20ug/ml。
封閉(blocking)是繼包被之后用高濃度的無關蛋白質溶液再包被的過程。抗原或抗體包被時所用的濃度較低，吸收后固相載體表面尚有未被占據的空隙，封閉就是讓大量不相關的蛋白質充填這些空隙，從而排斥在ELISA其后的步驟中干擾物質的再吸附。封閉的手續與包被相類似。zui常用的封閉劑是0.05%-0.5%的牛血清白蛋白，也有用10%的小牛血清或1%明膠作為封閉劑的。脫脂奶粉也是一種良好的封閉劑，其zui大的特點是價廉，可以高濃度使用（5%）。高質量的速溶食用低脂奶粉即可直接當作封閉劑使用，但由于奶粉的成份復雜，而且封閉后的載體不易長期保存，因此在試劑盒的制備中較少應用。 
封閉是否必要，取決于ELISA的模式及具體的實驗條件。并非所有的ELISA固相均需封閉，封閉不當反而會使陰性本底增高。一般說來，雙抗體夾心法，只要酶標記物是高活性的，操作時洗滌*，不經封閉也可得到滿意的結果。特別是用單抗腹水直接包被時，因其中大量非抗體蛋白在包被時同樣也吸附在固相表面，業已起到了類似封閉劑的作用。但在間接法測定中，封閉一般是不可少的。包被好的ELISA板干燥后放入密封袋或錫袋中，在低溫可保存數月。