至今為止,抗原修復有許多種方法,在這些方法中,有的是根據抗體的要求來進行,有的是根據抗原的表達程度來進行,我們則對每種病例每項檢測,都要求必須進行抗原修復,以達到抗原全面表達的*狀態。以下是上海研域生物總結出來的具體抗原修復方法。
(1)物理化學試劑抗原修復法。
1. 真空負壓抗原修復法:
① 切片脫蠟至水。
②0.3%H2O2甲醇真空負壓處理5分鐘。
③自來水洗,蒸餾水洗。
④0.01M檸檬酸鹽緩沖液(PH6.0),真空負壓干燥箱預先調至95℃,真空負壓處理10分鐘。
⑤待修復注降至室溫的一,PBS洗3次,隨后按選好的免疫組化染色方法進行染色。
2.微波輻射抗原修復法:
①切片脫蠟至水。
②0.3%H2O2甲醇處理10分鐘。
③自來水洗,蒸餾水洗。
④ 0.01M檸檬酸鹽緩沖液(PH6.0),于微波爐內微波輻射10分鐘,如檢測Er和Pr則需要20輻射分鐘左右。
⑤待修復液降至室溫后,PBS洗3次,隨后按選好的免疫組織化學的染色方法進行染色。
3.高壓抗原修復法:
①切片脫蠟至水。
②0.3%H2O2甲醇處理切片10分鐘。
③自來水洗,蒸餾水洗。
④切片放入抗原修復液中,邊同容器放入高壓鍋中加熱至沸騰。蓋上壓力閥至噴汽后持續1-4分鐘。
⑤待修復液恢復至室溫后,PBS洗3次,隨后按選好的免疫組織化學染色方法進行染色。
4.隔水熱抗原修復法:
①切片脫蠟至水。
②0.3%H2O2甲醇處理切片10分鐘。
③自來水洗,蒸餾水洗。
④切片放入0.01M檸檬酸鹽緩沖液(PH0.6)中,邊同容器一起放入水溶鍋中加熱,其間應不斷用溫度計測其溫度,待抗原修復液的溫度達到有效溫度后(92℃↑)。即開始計時,持續40分鐘。
⑤待抗原修復液恢復至室溫后,PBS洗3次,隨后按選定好的免疫組化染色方法進行染色。
5.電爐加熱抗原修復法:
①切片脫蠟至水。
②0.3%H2O2甲醇處理切片10分鐘。
③自來水洗,蒸餾水洗。
④ 將切片放入抗原修復液中于電爐上加熱,不時用溫度計測量溫度,當達92℃后,即可拔離電源,當溫度低于92℃時,再插上電源,如此反復持續至10分鐘左右。
⑤待抗原修復液降至室溫后,PBS洗3次,隨后按選定的免疫組化染色方法進行染色。
對各種抗原修復方法的評價。
1.真空負壓抗原修復法:
這是一種操作簡單,效果特佳,溫度恒定,能一次性處理大量切片的方法。該法的zui大的特點有四:一是各物質的分子在失重的情況下四處飄游,增加各分子間的碰撞機會;二是有恒定的溫度,既能使甲醛固定的蛋白發生變性,又不需要使抗原修復液達到沸騰,不會導致切片因抗原修復液的沸騰而離開載片,保證了染色的成功率,減少了因掉片而反復制片的麻煩,保證了病理報告的及時發生,為病人爭取更多的時間;三是不受條件限制,不管是金屬性的不是非金屬的都可以進行操作;四是可以一次性制作大批的切片。
2.微波輻射抗原修復法:
該法與上法相比,從實驗結果看,都不分上下。它是利用微波每秒以24億5千萬次的快速運動產生瞬間熱。當然,光靠微波的作用是不夠的,還必須依靠熱的作用,方能達到目的。應用微波輻射,它有雙重作用,微波輻射可以使各物質分子作極性運動。促進形成的醛鍵斷裂開。分子間運動所產生的瞬間熱,當達到有效的溫度后,就可導致甲醛固定后的蛋白的變性。該法的特點是:產熱迅速,容易操作,也容易引起抗原修復液的沸騰,使用微波爐時禁止使用金屬性的器皿,以防引起失火或爆炸。
3.高壓抗原修復法:
該法高壓和高熱來促進醛鍵的斷裂,當加熱至開鍋,加上高壓閥后,汽體噴出,此時的溫度已達121℃左右。該法被應用于一些較難修復的抗原,經多次實驗認為,該法效果不錯。
4.隔水熱抗原修復法:
該法應用隔水熱方法,效果不及前面三種方法,它需要較長時間的熱的作用,在早期應用于Er和Pr染色的抗原修復時,我們的修復時間為40分鐘,如果達不到這時間,效果將不理想。
5.電爐加熱抗原修復法:
該法是在沒有上述的設備時才選用的一種方法,當然效果是zui差的,因為它只是單靠熱的作用,這是遠遠不夠的,另外,電爐加熱必須常用溫度計來測量溫度,對其溫度不好控制,有時需要多次關閉電源來維持所需的溫度。
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