人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVEC-C)|通過STR鑒定

細胞名稱：人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVEC-C)

培養(yǎng)條件：Sciencecell ECM+10%特級胎牛血清（推薦S-FBS-AU-015）

細胞來源：ATCC細胞庫

代數(shù)：P3代細胞

人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVEC-C)|通過STR鑒定

一、傳代：

1.用75%酒精噴灑整個瓶消毒，將其平躺置于培養(yǎng)箱中進行1-3小時的緩沖，.然后置于無菌操作臺，打開瓶口，將其中的培養(yǎng)液去掉，再往其中加入5-6mL新鮮培養(yǎng)基并置于細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，根據(jù)細胞生長狀況及培養(yǎng)基顏色變化對其進行換液以及傳代；

2.待細胞長滿瓶底面積80%-90%，需要對其進行傳代，次傳代比例為1:2；

3.傳代步驟：將0.25%含EDTA胰酶置于37°預熱，倒掉培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基，往培養(yǎng)瓶中加入3-5 ml PBS，輕晃洗滌后棄去。往瓶中加1-2 ml預熱好的胰酶，置于37°孵育消化（次消化需時常取出置于顯微鏡下觀察，以顯微鏡下細胞觸角回收變圓、輕拍瓶壁見細胞脫落為好消化時間，記錄好消化時間，以便于下次消化），消化好后加入1ml*培養(yǎng)基終止消化。用移液槍輕輕吹打瓶壁上的細胞，使之*脫落，然后收集細胞懸液，1200rpm離心3min，棄上清，加入*培養(yǎng)基重懸細胞，進行傳代。

二、保存：

凍存條件：80%*培養(yǎng)基+10%FBS+10%DMSO

(備注：建議使用本公司的冷凍液HAKATA（H-W-100），用4度保存的冷凍液直接重懸細胞，不能預熱后使用。)

保存條件：液氮存儲

人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVEC-C)|通過STR鑒定細胞在生存過程中經(jīng)歷以下三個階段：

　　1.原代培養(yǎng)期(primary culture)

　　組織到次傳代時間大約為1～4周

　　特點：

　　細胞活躍移動,分裂,但不旺盛多呈二倍體核型。

　　原代與體內(nèi)原組織形態(tài)結構和功能活動基本相似。

　　各細胞的遺傳性狀互不相關，細胞相互依存性強，如果把這種稀釋分散成單細胞,在軟瓊脂培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)細胞克隆的形成率(cloning efficiency)下降，表明細胞獨立生存性差。

　　2.傳代期(passage)

　　初代培養(yǎng)細胞一經(jīng)傳代便稱之為細胞系(cell line)

　　特點：

　　細胞增殖旺盛，并維持二倍體核型，也叫二倍體細胞系(diploid cell line)為了保存二倍體細胞性質(zhì)，細胞應在初代或傳代早期凍存為好。

　　一般細胞在10代以內(nèi)凍存。

　　凍存配方：

　　向培養(yǎng)液加入保護劑二甲基亞砜(DMSO)或甘油,封入安瓶中。

　　存于在液氮中溫度可達到-196℃，可長期儲存。如解凍后細胞復蘇，仍能繼續(xù)增殖生長，細胞性狀不受影響，成為保存細胞主要的手段。

　　3.衰退期

　　特點：細胞仍生存 增殖減慢 不增殖 輪廓增強 衰退凋亡

　　注意：細胞在三期中的任何一期(一般發(fā)生在傳代后期或衰退期)在某些因素影響下,如血清質(zhì)量不佳、病毒污染、溫度和pH不穩(wěn)等,細胞可能發(fā)生自發(fā)轉化(spontaneous transformation);

細胞可能獲得永生性(immortality) 或稱為惡性性(malignancy)。細胞獲得持久性的增殖能力,這樣的細胞群體稱為連續(xù)細胞系(continuous cell line)。而細胞獲得不死性后,細胞核型大多變成異倍體(heteroploid)接觸抑制消失。

人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVEC-C)|通過STR鑒定

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培養(yǎng)過程中，可能遇到幾個問題：

1、細胞培養(yǎng)中出現(xiàn)黑點是污染嗎?如何處理?

一旦您在細胞培養(yǎng)的過程中發(fā)現(xiàn)有黑點生成，首先，要肉眼觀察微生物培養(yǎng)基是否混濁，然后，在鏡下觀察培養(yǎng)細胞生長的狀態(tài)，黑點是否游動。如果細胞被污染，微生物則會大量繁殖，微生物培養(yǎng)基就會迅速變黃、變混濁。污染包括細菌污染、支原體污染等。

如果在鏡下觀察細胞，生長狀態(tài)良好，與黑點出現(xiàn)前相比，沒有任何變化，那么，黑點的出現(xiàn)可能與以下幾種情況有關：

(1)細胞生長過老，破碎的細胞殘骸;

(2)血清質(zhì)量不好，反復凍融的結果;

(3)配制培養(yǎng)基的pH值偏高，不宜細胞生長;

(4)培養(yǎng)原代細胞中出現(xiàn)小黑點，可能是原代組織中的雜質(zhì)，多次傳代可以消除。

2、EDTA在細胞消化過程中起什么作用?

EDTA是一種螯合劑，它可以螯合Ca2+ 或Mg2+，而細胞表面很多和培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶結合的蛋白都是帶有Ca2+ 或Mg2+的，把這些離子螯合后，可以加速細胞和培養(yǎng)皿的脫離，促進消化。上皮類細胞的連接存在“橋粒”結構，是細胞間“牢固”的連接，但橋粒的形成依賴于鈣離子的存在。在胰酶消化細胞時，加入EDTA，可以破壞細胞的橋粒結構，使細胞能夠分散成單個細胞。通俗地說，就是破壞細胞間的粘連。

3、如何選用特殊細胞系培養(yǎng)基?

培養(yǎng)某一類型細胞沒有固定的培養(yǎng)條件。選擇DMEM做貼壁細胞培養(yǎng)、RPMI-1640做懸浮細胞培養(yǎng)。另外還可以參考ATCC網(wǎng)站的推薦信息。

4、怎樣讓細胞適應新的條件?

從原條件逐漸過度：1/4、1/2、3/4，后是*新培養(yǎng)基。

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