抗體:機體在抗原物質刺激下,由B細胞分化成的漿細胞所產生的、可與相應抗原發生特異性結合反應的免疫球蛋白。免疫球蛋白英文縮寫為Ig.
抗體的效價:指抗體的物理狀態及其在體內的滯留時間,以其與抗原反應的多少來表示其免疫效果。
抗體效價的檢測(一般用ELISA間接法進行檢測)
1)2個參照:陰性參照為預取血血清,均以1抗起始濃度稀釋;陽性參照為以前陽性血清或者細胞上清
2)于96空板中每孔適量的抗原,邊沿孔應盡量避免使用,會降低細光值,影響結果。于4℃過夜,緊急情況也可以37℃孵育2小時。
3)倒掉抗原,每孔加入200ul的封閉液,4℃過夜或者37℃孵育2小時。
4)倒去封閉液,在吸水紙上拍打盡量吸干殘留液體,用洗滌液洗板三次,每次盡量拍干殘留液體,若要放置一段時間,盡量風干板子,或30℃烘干并用封口袋封好于-20℃存放。
5)取包好的96孔板,孔加入陰性參照液50ul,第二孔加入陽性參照液50ul,第三孔加入稀釋的抗體(1:500=抗體:封閉稀釋液),后面的第四孔到第12孔加入50ul的封閉稀釋液,然后取50ul稀釋的抗體進行梯度稀釋,第12孔取出50ul的液體,保證每孔液體為50ul。再于37℃孵育1 小時。
6)倒掉液體,用洗滌液洗板三次,拍干。每孔加入100ul的HRP標記的2抗(1:2000),于37℃孵育45分鐘。
7)倒掉液體,有洗滌液洗板三次,拍干。每孔加入100ul的TMB底物(A+B等體積配置,現配現用)溫室孵育5—20分鐘(根據顏色的改變速度)。
8)每孔加入100ul的終止液(0.M草酸),在酶標儀上讀取450nm的吸光度。
抗體的純化。(一般用親和純化,這種方法得到的抗體的純度高一些。)
(1) 親和柱的制備
1)稱取0.3mg溴化QING活化的瓊脂糖凝膠加入1mmol/L的鹽酸中,4`C過夜使其充分溶漲,可獲得1ml溶漲膠。
2)將凝膠轉移入純化柱中,用約30ml 1mmol/L的鹽酸洗介質3次。
3)用偶聯緩沖液洗介質一次,因為活化基團在偶聯緩沖液PH值下易水解,所以此步驟zui hao在幾分鐘內完成。
4)將溶解在5ml偶聯緩沖液中的10-60nmol的配體加入凝膠中,如需測定結合效率一定要取少量陪體溶液待測。
5)溫室下輕輕混合搖動2小時,或4`C過夜,如需測定結合效率此步驟結束后取少量溶液待測。
6)用30ml的偶聯緩沖液洗介質一次。
7)加入15ml阻斷緩沖液溫室孵育2小時或4`C過夜。
8)依次用20ml的偶聯緩沖液和20ml的乙酸鹽緩沖液洗介質一次。重復4次步驟8。
9)重復4次步驟8。
10)配體固相化完成,可用于純化。
11)若不立即使用,用20%的乙醇封存。
(2)抗體的純化
1)原血清用PBS等體積稀釋,混勻1min,5000-10000r/min,4-20離心15分鐘,取上清,并留樣送檢。
2)用層析儀或手工,10倍體積的PBS 2-4ml/min流速清洗平衡柱子。
3)稀釋離心完的上清樣品,0.5-1ml/min流速上樣。
4)上樣完后,用15倍體積的PBS2-4ml/min流速清洗平衡柱子,洗去柱子上殘留的雜蛋白。
5)用5-10倍體積的Anitibody Elute Buffer C 洗脫結合在親和柱子上的抗體,分管收集,沒管收集1ml并預先滴加100ul Anitibody Elurte Buffer D調PH至中性(PH7-7.5),如果有層析儀也可以根據層析儀紫外吸收峰檢測收集。
6)洗脫完畢后,柱子用5倍體積的PBS 2-4mi/min流速清洗平衡。
7)用20%的酒精封存柱子,4`C保存。
(3)抗體的濃縮
1)一般收集濃度較高的幾管洗脫液,無須濃縮,若弄多實在太低(小于0.5mg/ml),則將收集的餾分加和起來。
2)轉移入15ml 的超濾管,3500r/min離心20分鐘左右(根據要濃縮的體積摸索離心時間),將濃縮好的抗體小心的用移液器取出來。
3)取700ul 濃縮的抗體檢測280nm的吸光度,讀數不要超過2,用吸光度讀數除以1.35,即為抗體的大致濃度。抗體的濃度也可以用(OD280nm-0.35xOD495nm)1.4這個公式計算。濃縮的程度:使抗體的濃度在0.5-1mg/ml之間hao。hou通過濃度x體積計算抗體的總量。
(4)抗體的保存
抗體中添加40-50%甘油,可以短時間存放于4℃,如需以后使用,一般500ul/管凍存于-20℃或者更低溫度的冰箱中。
(5)抗體純度的鑒定
一般而言,我們在將抗體純化以后,如果想知道抗體的純度和濃度究竟怎么樣,就需要走個SDS-PAGE電泳。電泳的方法在網上到處都是,在此就不多說了。
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