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如何去除巨噬細(xì)胞?

來源:蘇州螞蟻淘生物科技有限公司   2019年03月26日 14:50  

    如何去除巨噬細(xì)胞?目前清除巨噬細(xì)胞常用的是clodronate liposomes,由荷蘭的Nico  van  Rooijen教授研發(fā)。目前已成立公司Liposoma B.V.

    蘇州螞蟻淘生物科技有限公司是其中國大陸的授權(quán)總代理

去除巨噬細(xì)胞(depletion of macrophages)是研究巨噬細(xì)胞功能的重要方法。荷蘭阿姆斯特丹Vrije UniversityNico van Rooijen教授開發(fā)的一款Clodronate liposomes,可以利用巨噬細(xì)胞的內(nèi)吞機(jī)制,將膜不通透性的氯磷酸(Clodronate)帶入細(xì)胞內(nèi),從而達(dá)到去除巨噬細(xì)胞的目的。

作用原理:

兩親性磷脂分子在水中可以形成同心圓形式的磷脂雙分子層球體,磷脂雙分子層中間通過水相分隔。溶解在水溶液中的氯磷酸鹽在形成脂質(zhì)體的過程中被包裹進(jìn)磷脂雙分子層之間的水相中(如圖1)。游離的氯磷酸鹽不能自由的通過脂質(zhì)體的磷脂雙分子層。隨著脂質(zhì)體被巨噬細(xì)胞吞噬,在巨噬細(xì)胞溶酶體磷酸酶的作用下,溶解在脂質(zhì)體水相中的氯磷酸鹽就可以被逐步釋放出來,并累積在細(xì)胞內(nèi),當(dāng)其達(dá)到一定濃度時,巨噬細(xì)胞將會受到不可逆轉(zhuǎn)的損傷,從而進(jìn)入凋亡過程(如圖2)。從死亡的巨噬細(xì)胞中釋放出來的氯磷酸鹽在細(xì)胞外的半衰期極短(大約15min),可以通過泌尿系統(tǒng)排除體外。

 

1氯磷酸-脂質(zhì)體Clodronate liposomes復(fù)合物。在脂質(zhì)體的形成過程中氯磷酸通過溶解在水溶液中被包裹進(jìn)磷脂雙分子層之間的水相中。

 

2巨噬細(xì)胞清除原理。包裹著氯磷酸(方塊)的脂質(zhì)體通過巨噬細(xì)胞的內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞,與溶酶體(L)融合后,在磷脂酶(箭頭)的作用下,釋放出氯磷酸,當(dāng)細(xì)胞內(nèi)氯磷酸的濃度達(dá)到一定濃度,就會對巨噬細(xì)胞造成不可逆轉(zhuǎn)的損害,從而迫使其進(jìn)入細(xì)胞凋亡

產(chǎn)品性質(zhì):

1ml脂質(zhì)體體懸液中所含的氯磷酸大約為5mg。所用的磷酸鹽緩沖液為10 mM Na2HPO4,10 mM NaH2PO4,140 mM NaCl。

脂質(zhì)體體內(nèi)注射:

隔日尾靜脈注射200μl Clodronate liposome,根據(jù)實驗要求制定注射日程。通過免疫組化或流式檢測巨噬細(xì)胞去除效率。

尾靜脈注射方法:

(1)將小鼠放在倒扣的飯盒內(nèi),從孔口拉出尾巴,小鼠的尾部有2條動脈和3條靜脈,2條動脈分別在尾部的背側(cè)面和腹側(cè)面,3條靜脈呈品字型分布,一般采用左右兩側(cè)的靜脈;

(2)將紗布浸泡于約70度的溫水中,拿出后包裹尾巴,以達(dá)到使尾部血管擴(kuò)張及軟化表皮角質(zhì)的目的;

(3)行尾部靜脈注射時,以左手拇指和食指前后摁住鼠尾,留出約2cm一段,使皮膚緊張,靜脈更為充盈,右手持1ml針頭注射器,使針頭與靜脈平行(小于30°角),從尾巴的下1/4處進(jìn)針,開始注入藥物時應(yīng)緩慢,仔細(xì)觀察,如果無阻力,無白色皮丘出現(xiàn),說明已刺入血管,可正式注入藥物。

(4)有的實驗需連日反復(fù)尾靜脈注射給藥,注射部位應(yīng)盡可能從尾端開始,按次序向尾根部移動,更換血管位置注射給藥。拔出針頭后,用棉球按住注射部位輕壓1-2min,止血。

效果展示:案例一:案例二:

左圖顯示的是正常脾臟細(xì)胞中陽性巨噬細(xì)胞的染色結(jié)果。右圖為Clodronate-liposome注射2天后觀察的結(jié)果,可以發(fā)現(xiàn)只剩下少量的巨噬細(xì)胞。左圖表示正常肝臟細(xì)胞中陽性的Kupffer細(xì)胞。右圖表示Clodronate-liposomes注射2天后,肝臟Kupffer細(xì)胞染色結(jié)果,Kupffer細(xì)胞基本被清除。

FAQ:

Q:收到Clodronate liposomes后該如何操作?A:收到氯磷酸脂質(zhì)體后,如果不能馬上使用,需要放置在4℃冰箱。禁止凍存!使用時作為原液使用,不能進(jìn)行稀釋。脂質(zhì)體很容易發(fā)生沉淀,建議使用之前輕輕混勻,另外4℃的氯磷酸脂質(zhì)體不能馬上使用,需要恢復(fù)到室溫才能進(jìn)行注射。

Q: Clodronate liposomes能否用于體外巨噬細(xì)胞清除?A:產(chǎn)品可以用于體外巨噬細(xì)胞的清除,但是這種方法比較適合體內(nèi)實驗。主要是由于在體外培養(yǎng)過程中,從死亡細(xì)胞釋放的氯磷酸或者是從脂質(zhì)體中“滲漏”出來氯磷酸,會一直存在于培養(yǎng)基中,但是在體內(nèi),氯磷酸的半衰期很短,很快就會被腎臟清除。雖然游離的氯磷酸不會進(jìn)入細(xì)胞也不會進(jìn)入脂質(zhì)體,但是一旦他們在培養(yǎng)基中積累就會慢慢地進(jìn)入細(xì)胞中。

Q:在靜脈注射Clodronate liposomes后動物很快就死亡了,是什么原因?A:一方面有可能是動物注射了不均一的脂質(zhì)體懸液。建議在使用之前輕輕搖晃混勻。脂質(zhì)體在體外一段時間后會發(fā)生沉降。如果在很長一段時間內(nèi)需要一次注射多只動物,那么脂質(zhì)體便會在注射器中發(fā)生沉淀,形成不均一懸液,這樣一來,只注射的計量與后一只注射的計量就會發(fā)生明顯的變化。另外一方面有可能是脂質(zhì)體剛從冰箱取出后,沒有恢復(fù)到室溫。

Q:動物在注射Clodronate liposomes后幾天就死亡了?A:這個可能是受到細(xì)菌的污染,體內(nèi)清除巨噬細(xì)胞后會增加例如病毒粒子,細(xì)菌或者酵母感染的幾率。

Q:靜脈注射Clodronate liposomes后大鼠脾臟/肝臟中的ED1+細(xì)胞并沒有*消失?A:大鼠中成熟的巨噬細(xì)胞呈現(xiàn)ED1和ED2雙陽性,但是有一些沒有吞噬功能的或者吞噬作用小的前體細(xì)胞也是ED1+,但是呈現(xiàn)ED2-。因此,所有ED2+的細(xì)胞都可以被*清除,但是ED1+的細(xì)胞卻只能被部分清除,清除的比率取決于前體/成熟巨噬細(xì)胞的比例。

Q: Clodronate liposomes沒有達(dá)到期望的效果?A:氯磷酸脂質(zhì)體都是大批量的生產(chǎn),每批次都會對氯磷酸的濃度以及一些可能的污染物進(jìn)行檢測,確保無誤后才會銷售給客戶。另外,脂質(zhì)體容易收到溫度的影響。正確的運(yùn)輸和儲存方式是4~8℃,懸液既不能被凍存,也不能被加熱超過30℃。自收到貨物起,需要在3個月內(nèi)使用完,不然有可能會影響使用的效果。

Q:在靜脈注射時,能不能增加注射的體積?A:靜脈注射時需要依據(jù)動物的體重,不能超過0.1ml/10mg,但是進(jìn)行腹腔注射可以適當(dāng)?shù)脑黾幼⑸涞捏w積。皮下注射需要根據(jù)注射位點(diǎn)的容量進(jìn)行決定。

 

 

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