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腔隙性腦梗死(CLL)動物模型

來源:上海申知心生物科技有限公司   2018年10月12日 11:16  

腔隙性腦梗死(CLL)動物模型

腔隙性腦梗死為缺血性腦卒中的重要一型,由腦部深穿動脈及其分支的特殊病變所至。采用腦內大血管注射月桂酸鈉可選擇性損傷大鼠腦穿支動脈內皮細胞,導致微小動脈內原位血栓形成,從而建立大鼠腔隙性腦梗死模型。

(1)復制方法  雄性大鼠,體重為250~300g。經腹腔注射戊巴妥鈉(按50~60mg/kg體重的劑量)或水合氯醛(按350~400mg/kg體重的劑量)麻醉后,剪除頸部毛發,手術區皮膚常規消毒。頸部切口,分離右側頸總、頸內和頸外動脈,結扎同側枕動脈、甲狀腺上動脈、翼腭動脈及頸外動脈遠心端。PE-50導管插入頸內動脈,向頸內動脈內緩慢注入含100μg的月桂酸鈉溶液0.1ml,期間用微動脈夾暫時夾閉頸總動脈。術畢結扎頸內動脈,縫合切口,并消毒創面。48h后,動物麻醉后PE-50導管插入頸總動脈。第2次注射同等量的月桂酸鈉溶液于頸總動脈,隨后結扎頸總動脈。

(2)檢測方法和指標

1)行為學檢測于第2次注射月桂酸鈉3d后對動物進行行為學檢測。

①姿勢反射試驗:距地面1m提起鼠尾,通過觀察其雙前肢的姿勢進行評分。無神經功能缺損者為0分,表現為雙前肢伸展;輕度神經功能缺損者為1分,表現為左前肢貼向前胸;重度神經功能缺損者為2分,除有1分的表現外,其上半身卷曲。

②肢體不對稱應用試驗:試驗在直徑20cm,高30cm的圓桶中完成。正常情況下,大鼠在圓桶中用雙前肢觸及桶壁,且應用雙側前肢的頻率應該相等。有缺血損傷的鼠偏癱側肢體應用較少。可應用下列公式進行評分。

(右前肢獨立應用的次數-左前肢獨立應用的次數)÷(右前肢獨立應用的次數+左前肢獨立應用的次數+雙側前肢同時應用的次數)

2)組織學檢測  行為學測試結束后處死動物。10%甲醛固定鼠腦,從前腦額極起,每隔2mm冠狀切片(片厚5βm),共取5片,第3片即可包含海馬區。磷烏酸蘇木精染色(PTAH)行組織學觀察;勒克司堅牢藍-HE染色(Luxol fast blue-HE, LFB-HE)用以進行腦梗死面積測定;也可進行透射電鏡技術制備成半薄片和超薄片,在電鏡下觀察。取材部位包括注藥側大腦中動脈、海馬、皮質和丘腦區域。

(3)檢測結果

1)行為學檢測結果顯示  在姿勢反射試驗中,70%以上的動物出現輕、重度神經功能缺損。在肢體不對稱應用試驗中,腦損傷的動物平均分數明顯大于空白對照組。

2)光學顯微鏡分析  PTAH染色鏡下見部分小血管周圍間隙擴張及周圍腦組織水腫。白質內穿支小動脈血管內皮細胞腫脹,管腔內血小板附壁,血小板之間纖維蛋白絲早期形成;LFB-HE染色見大鼠注藥側大腦半球的皮質、丘腦、海馬區有多發的腔隙梗死灶,組織片染色表現為淡染病灶。有早、中、晚期的軟化灶,有的病灶中心囊性變。

3)超微結構分析  大鼠注藥側大腦半球的皮質、丘腦、海馬區可見毛細血管內皮均有不同程度的破壞、隆起。部分管腔可見壞死脫落的內皮細胞。毛細血管外側星形細胞足突不同程度腫脹,血腦屏障破壞,血管鄰近的神經細胞固縮。注藥對側大腦半球毛細血管內皮完整、無損傷,星形細胞無腫脹。注藥側大腦中動脈內膜光滑,內皮細胞無破壞。

(4)模型特點  月桂酸鈉可選擇性損傷穿支動脈內皮細胞,對大腦中動脈無影響。穿支動脈周圍間隙的增加表明月桂酸鈉對內皮細胞可能是一種直接的損害,由此而導致了血管通透性的增加。損傷后的小血管壁可觸發血小板黏附和聚集,與凝血系統共同參與血栓的形成,所形成的微血栓位于受損小動脈的原位,且包含有纖維蛋白絲。電鏡下受損血管周圍的神經元固縮,顯示隨后發生的小梗死灶與局部微血栓的形成有密切關系。血流在從大動脈流向小動脈的過程中速度是逐漸減慢的,因此推測月桂酸鈉與穿支動脈壁之間的接觸時間大大長于與大動脈的接觸時間,這一時間的不同是造成選擇性穿支動脈內皮損傷的原因。月桂酸鈉損傷穿支動脈內皮的程度有賴于給藥劑量和給藥時間兩個因素,以100μg/次,2次注射為宜。這是造成穿支動脈內皮損害,并能在原位形成小梗死灶,同時對大腦中動脈不造成損害的合適條件。

(5)比較醫學  CLI在臨床表現為相應的腔隙綜合征,兩次注射月桂酸鈉的過程基本模擬臨床CLI患者急性期的發病特點。月桂酸鈉注射3d后大多數動物行為學表現異常,這與部分患者于發病后72h左右癥狀達高峰相吻合。實驗第6日大多數鼠有多發的小梗死灶存在,病變多分布于丘腦、海馬、皮質,符合臨床CLI病灶的分布特點。梗死灶大小也符合CLl的診斷標準。此模型為研究該病的病理生理和開發針對性強的神經保護劑具有的價值。

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