實(shí) 驗(yàn) 原 理
誘導(dǎo)細(xì)胞融合的主要方法有:病毒誘導(dǎo)融合,化學(xué)融合劑誘導(dǎo)融合和電融合。
1. 病毒誘導(dǎo)融合:有許多種類的病毒能介導(dǎo)細(xì)胞融合,zui常用的是滅活的仙臺(tái)病毒(HVJ),為RNA病毒。病毒誘導(dǎo)細(xì)胞融合的過程有:首先是細(xì)胞表面吸附許多病毒粒子,接著細(xì)胞發(fā)生凝集,幾分鐘至幾十分鐘后,病毒粒子從細(xì)胞表面消失,而就在這個(gè)部位鄰接的細(xì)胞的細(xì)胞膜融合,胞漿相互交流,zui后形成融合細(xì)胞。
2. 化學(xué)融合劑誘導(dǎo)融合:化學(xué)融合劑主要有脂肪酸衍生物、脂質(zhì)體、鈣離子、水溶性高分子化合物、水溶性蛋白質(zhì)和多肽,其中zui常用的是聚已二醇(PEG)。PEG用于細(xì)胞融合至少有兩方面的作用:①可促使細(xì)胞凝結(jié);②破壞互相接觸處的細(xì)胞膜的磷脂雙分子層,從而使相互接觸的細(xì)胞膜之間發(fā)生融合,進(jìn)而細(xì)胞質(zhì)溝通,形成一個(gè)打的雙核或多核融合細(xì)胞。
3. 電融合:是指細(xì)胞在電場(chǎng)中極化成偶極子,并沿著電力線排列成串,然后用高強(qiáng)度、短時(shí)程的電脈沖擊穿細(xì)胞膜而導(dǎo)致細(xì)胞融合。
細(xì)胞融合技術(shù)在基因定位、基因表達(dá)產(chǎn)物、腫瘤診斷核治療、生物新品種培育及單克隆抗體技術(shù)等領(lǐng)域有著非常廣泛的應(yīng)用前景。單克隆抗體技術(shù)就是通過細(xì)胞融合技術(shù)發(fā)展起來的,在生命科學(xué)研究核應(yīng)用方面產(chǎn)生了重大影響。
實(shí) 驗(yàn) 操 作
在公雞翼下靜脈抽取2ml雞血,加入盛有8ml的Alsever液中,使血液與Alsever液的的比例達(dá)1∶4,混勻后可在冰箱中存放一周;
細(xì)胞融合加入0.3ml的GKN溶液,制成細(xì)胞懸液;(也可以用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù),用GKN液將其調(diào)整為106個(gè)/ml);
取以上細(xì)胞懸液0.2ml放入1ml的EP管中,然后放入37℃水浴中預(yù)熱,同時(shí)將50%PEG液一并預(yù)熱20min;
20min后將0.2ml的50%PEG溶液逐滴沿離心管壁加入到0.2ml細(xì)胞懸液中,邊加邊搖勻,然后放入37℃水浴中保溫20min;
20min后,加入GKN溶液1ml,靜止于水浴中20min左右;
1500r/min離心5min,棄去上清,加GKN溶液再離心1次;
棄去上清,加入GKN液少許,混勻,取少量懸浮于載玻片上,加入詹納斯綠染液,用牙簽混勻,3min蓋上蓋玻片,觀察細(xì)胞融合情況。
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