人肝轉移癌細胞培養技術

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第六節 無蛋白培養基與限定化學成分培養基

一、無蛋白培養基（protein free midium,PFM）：即不含有動物蛋白的培養基。無血清培養基仍含有較多的動物蛋白，如胰島素，轉鐵蛋白、牛血清白蛋白等。從生物技術發展的趨勢來看，不含動物蛋白的培養基又廣泛的應用前景，許多利用基因工程技術重組的蛋白質zui終要應用于人體，如果再生長過程中使用了含有動物蛋白質的培養基，純化過程就比較復雜，zui終要達到一定的質量標準也有一定的難度。無蛋白培養基就是為了適應這發展趨勢而出現的，許多無蛋白培養基添加了植物水解物以替代動物激素、生長因子的作用。市場上已有適合多種細胞生長的無蛋白培養基。

二、限定化學成分培養基(chemical defined medium,CDM)：是指培養基中的素有成分都是明確的，它同樣不含有動物蛋白，同樣也不是添加了植物水解物，而是使用了一些已知結構與功能的小分子化合物，如短肽、植物激素等。這種培養基更有利于分析細胞的分泌產物。目前已經有適合于293細胞、CHO細胞、雜交瘤細胞生長的CDM問世，上海恒利安生物科技有限公司生產的水解乳蛋白培養基就屬于CDM。

T-47D細胞，人乳腺管癌細胞

CCD-1095Sk細胞，人乳腺浸潤性導管癌旁皮膚細胞

SK-BR-3*細胞，人乳腺腺癌細胞

SW 1353細胞，人軟骨肉瘤細胞

GNM 細胞，人上頜牙齦癌頸淋巴結轉移癌細胞

T6細胞，人舌癌細胞

 TSCCA細胞，人舌鱗癌細胞

CAL 27細胞，人舌鱗癌細胞

Tca-8113細胞，人舌鱗癌細胞

TSCCa細胞，人舌鱗癌細胞

CRT 細胞，人神經膠質瘤細胞

U251細胞，人神經膠質瘤細胞

SH-SY5Y細胞，人神經瘤細胞

BE(2)-M17細胞，人神經母瘤細胞

CRL-2268細胞，人神經母瘤細胞

IMR-32細胞，人神經母瘤細胞

SH-5Y5Y細胞，人神經母瘤細胞

SK-N-AS細胞，人神經母瘤細胞

SK-N-BE(2)細胞，人神經母瘤細胞

SK-N-MC細胞，人神經上皮瘤細胞

A-498細胞，人腎癌細胞

A498-EGFP-puro細胞，人腎癌細胞

ACHN細胞，人腎癌細胞

KC細胞，人腎癌細胞

OS-RC-2細胞，人腎癌細胞

G-401細胞，人腎癌Wilms細胞

SK-NEP-1細胞，人腎母瘤細胞

SW-13細胞，人腎上腺皮質癌細胞

NCI-H295R細胞，人腎上腺皮質腺癌細胞

KP-N-NS細胞，人腎上腺神經母瘤(腦轉移)細胞

NCI-H205細胞，人腎上腺腺瘤細胞

786-O(786-0)細胞，人腎透明癌細胞

CaKi-1細胞，人腎透明癌細胞

CaKi-2細胞，人腎透明癌細胞

786-0細胞，人腎透明腺癌細胞

ACHN細胞，人腎透明腺癌細胞

769-P細胞，人腎腺癌細胞

HuTu-80細胞，人十二脂腸腺癌細胞

CaES-17細胞，人食管癌細胞第七節 其他細胞培養用液

在細胞培養過程中，除了培養基外，還經常用到一些平衡鹽溶液、消化液、pH調整液等。

一、平衡鹽溶液（balanced salt solution,BSS）：主要是由無機鹽、葡萄糖組成，它的作用是維持細胞滲透壓平衡，保持pH穩定及提供簡單的營養。主要用于取材時組織塊的漂洗、細胞的漂洗、配制其他試劑等。zui簡單的BSS是Ringer。D-Hank's與Hank's的一個主要區別是前者不含有Ca2+、Mg2+，因此D-Hank's常用于配制胰酶溶液。Earle平衡液含有較高的NaHCO3(2.2g/L),適合于5%CO₂ 的培養條件，Hank's平衡液僅含有0.35g/L NaHCO₃，不能用于5%CO₂的環境，若放入CO₂培養相，溶液將迅速變酸，使用時應注意。

配制溶液應使用雙蒸水或去離子水。如果配方中含有Ca²⁺、Mg²⁺，應當首先溶解這些成分。配好的平衡鹽溶液可以過濾除菌或高溫滅菌。

二、消化液：取材進行原代培養時常常需要將組織塊消化解離形成細胞懸液，傳代培養時也需要將貼壁細胞從瓶壁上消化下來，常用的消化液有胰酶（Trypsin）溶液和EDTA溶液，有時也用膠原酶（collagenase）溶液。

1、胰酶溶液：胰酶活性可用消化酪蛋白的能力表示，常見有1：125和1：250，即一份胰酶可消化125或250份酪蛋白。組織培養用胰酶溶液一般配制成0.1-0.25%濃度，配制時要用不含Ca²⁺ 、Mg²⁺及血清的平衡鹽溶液（如前面的D-Hank's），因為這些物質會對胰酶產生抑制作用。胰酶作用及溶解的*pH是8-9，配制胰酶溶液應將液體調至pH8左右，充分溶解，過濾除菌。過濾后可以再調只pH7.5，也可不調。

使用細胞清洗液配制胰酶消化液：含0.5%胰酶的細胞清洗液（100ml細胞清洗液加0.5g胰酶），過濾除菌，分裝于4度保存。

2、EDTA溶液：EDTA溶液也常用來解離細胞，它的作用機制是破壞細胞間的連接。對于一些貼壁特別牢固的細胞，還可以用EDTA和胰酶的混合液進行消化。EDTA溶液的使用濃度為0.02%，配制時應加堿助溶，配制后可過濾除菌，也可高溫消毒滅菌。

3、膠原酶溶液：膠原酶在上皮類細胞原代培養時經常使用，膠原酶作用的對象是膠原組織，因此不容易對細胞產生損傷。膠原酶的使用濃度為0.1-0.3mg/L或200000U/L,作用的*pH為6.5。膠原酶不受Ca²⁺ 、Mg²⁺及血清的抑制，配制時可用PBS。

三、pH調整液:常用的有HEPES液和NaHCO₃溶液。

1、NaHCO₃溶液：NaHCO₃是培養基中必須添加的成分，一般情況下按說明書的要求準確添加，以保證培養基在5%CO₂的環境下pH達到設計標準。如果是封閉式培養，即不與5%CO₂的環境發生交換達到平衡，所使用的培養基就不能按照說明書所要求加入NaHCO₃。此時常用5.6%或7.4%的NaHCO₃溶液調節培養基，使之達到所要求的pH環境。

2、HEPES溶液：是一種弱酸，中文名字是羥乙基哌秦乙硫磺酸，對細胞無毒性，主要作用是防止培養基pH迅速變動。在開放式培養條件下，觀察細胞時培養基脫離了5%CO₂的環境，CO₂ 氣體迅速逸出，pH迅速升高，若加了HEPES，此時可以維持pH7.0左右。一般在進行克隆化培養時要添加HEPES。

四、抗生素:常用的是青鏈霉素，俗稱“雙抗溶液”。青霉素主要是對革蘭陽性菌有效，鏈霉素主要對革蘭陰性菌有效。加入這兩種抗生素可預防絕大多數細菌污染。通常使用青霉素終濃度0.007-0.008g/100ml,鏈霉素終濃度0.01g/100ml。一般配制成100倍濃縮液，可用PBS或培養基配制。

五、谷氨酰胺補充液:谷氨酰胺在細胞代謝過程中起重要作用，合成培養基中都要添加，由于谷氨酰胺在溶液中很不穩定容易降解，4℃下放置7天即可分解約50%，所以都是在使用前添加。配制好的培養液（含谷氨酰胺）在4℃放置2周以上時，要重新加入原來量的谷氨酰胺，故需單獨配制谷氨酰胺，以便臨時加入培養液內。谷氨酰胺使用終濃度為0.002mol/L。一般配制為100倍濃縮液，即濃度為200mmol/L（29.22g/L），配制時應加溫30℃，*溶解后過濾除菌，分裝至小瓶，儲存于－20℃。使用時，在每100ml培養液中加入0.5~2ml谷氨酰胺濃縮液，終濃度為1~4mmol/L。

六、二肽谷氨酰胺（L-丙氨酰-L-谷氨酰胺）

在細胞培養液中L-谷氨酰胺是大部分細胞培養基的基本成分；而L-谷氨酰胺是一種并不穩定的氨基酸，在中性的水溶液中會自發降解；需要頻繁地補加L-谷氨酰胺。因而在培養操作過程中經常：

（1）頻繁打開蓋子，增加了破壞無菌狀態的可能性；

（2）過多的追加L-谷氨酰胺，增加了培養基中氨的毒性水平。

二肽谷氨酰胺在細胞培養中穩定而不降解,可高壓滅菌,釋放毒性氨zui少!

二肽谷氨酰胺在細胞內被氨肽酶（E.C.3.4.11.2）所水解，產生L-谷氨酰胺和L-丙氨酸；因此在大部分細胞系統中二肽谷氨酰胺就可以象L-谷氨酰胺同樣有效地被利用。二肽谷氨酰胺是*替代物，它無需適應；既可用于貼壁細胞培養，也適合于懸浮細胞的培養。