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第四節 合成細胞培養基

合成培養基是根據天然培養基的成分，用化學物質模擬合成、人工設計、配制的培養基。它有一定的配方，是一種理想的培養基。目前合成培養基多達10多余種，有的培養基仍在不斷進行改良。早期組織培養是利用天然培養基，目前合成培養基已經成為一種標準化的商品，從zui初的基本培養基發展到無血清培養基、無蛋白培養基，并且還在不斷發展。合成培養基的出現極大的促進了組織培養技術的普及發展。

一、基本組分 基本培養基包括四大類物質：無機鹽、氨基酸、維生素、碳水化合物。

無機鹽：CaCl₂ KCl MgSO₄ NaCl NaHCO₃ NaH₂PO₄。對調節細胞滲透壓、某些酶的活性及溶液的酸堿度都是必須的。

氨基酸：纈氨酸、亮、異亮、蘇、賴、色、苯丙、蛋、組、酪、精氨酸、胱氨酸(L型)。它們都是細胞用以合成蛋白質的必需原料，不能由其他氨基酸或糖類轉化合成。除此之外，還需要谷氨酰胺(glutamine)。谷氨酰胺具有特殊的作用，對細胞的培養特別重要，能促進各種氨基酸進入細胞膜；它所含的氮是核酸中嘌呤和嘧啶的來源，還是合成—磷酸腺苷、二磷酸腺甘和三磷酸腺苷的原料。細胞需要谷氨酰胺合成核酸和蛋白質，谷氨酰胺缺乏可導致細胞生長不良甚至死亡。在配制各種培養液中都應補加一定量的谷氨酰胺。值得注意的是：谷氨酰胺在溶液中很不穩定，故4℃下放置1周可分解50%，使用中單獨配制，置-20℃冰箱中保存，用前加入培養液中。

維生素：是維持細胞生長的一種生物活性物質，在細胞中大多形成酶的輔基或輔酶，對細胞代謝有重大影響。脂溶性維生素(A、D、E、K)常從血清中得到補充。水溶性維生素包括牛物素、葉酸、煙酰胺、泛酸、吡哆醇、核黃素、硫胺素和B12。維生素C也是*的，對具有合成膠原能力的細胞更為重要。

碳水化合物：是細胞生命的能量來源，有的是合成蛋白質和核酸的成分。主要有葡萄糖、核糖、脫氧核糖和丙酮酸鈉等。體外培養動物細胞時，幾乎所有培養基或培養液中都以葡萄糖作為必含的能源物質。生物試劑銷售中心RS4:11細胞培養技術

葡萄糖和谷胺酰胺的合理使用：乳酸是葡萄糖不*氧化的產物。研究表明，體外培養條件下95％的葡萄糖轉變為乳酸，這降低了營養物質的代謝效率，降低培養基pH值，增加滲透壓。在氧氣供給不足的情況下，NADH轉運系統蘋果酸－天冬氨酸穿梭系統活性低而不能將糖酵解產生的NADH氧化磷酸化為NAD+，細胞只得以降低能量需求的方式如激活乳酸脫氫酶將糖酵解產生的丙酮酸與NADH反應生產乳酸和NAD+，從而保證了糖酵解的順利進行。另一個可能的解釋是連接糖酵解與TCA循環的特異性酶如丙酮酸脫氫酶復合物、磷酸丙酮酸羧化酶激酶和丙酮酸羧化酶活性低下，直接導致糖酵解與TCA循環的失衡。因此體外培養條件下，葡萄糖主要經糖酵解降解，產生過量的乳酸。減少乳酸生產zui常用的方法是限制培養基中葡萄糖的含量，但葡萄糖含量過低可造成細胞營養供應不足，細胞生長抑制。該方法需要對葡萄糖的消耗與需求、乳酸的生產速率以及目的蛋白的表達量等參數進行綜合考慮方可應用。

SUER1153(XR)     HCC-366細胞，

SUER1154(XR)     HCC38細胞，

SUER1155(XR)     HCC4006細胞，

SUER1156(XR)     HCC-44細胞，

SUER1157(XR)     HCC-56細胞，

SUER1158(XR)     HCC70細胞，

SUER1159(XR)     HCC-78細胞，

SUER1160(XR)     HCC827細胞，

SUER1161(XR)     HCC-827-GR5細胞，

SUER1162(XR)     HCC-95細胞，

SUER1163(XR)     HCT 116細胞，

SUER1164(XR)     HCT-15細胞，

SUER1165(XR)     HCT-8細胞，生物試劑銷售中心RS4:11細胞培養技術

在目前常用的培養基中，葡萄糖和谷胺酰胺是體外培養動物細胞的主要能源，其能量代謝通路與體內*不同，表現為葡萄糖主要經糖酵解途徑為細胞提供能量，谷胺酰胺大部分通過不*氧化途徑，另一小部分通過*氧化為細胞供能。因此，適當的調整細胞內的代謝途徑，使之能促進細胞的快速生長和產物合成，同時減少代謝抑制物的生成是行之有效的一種策略。

許多動物細胞如CHO、BHK和雜交瘤細胞對營養物質葡萄糖和谷氨酰胺的消耗利用很快。然而對于細胞生長而言，二者的快速利用并非細胞必需；相反相當一部分轉化為代謝廢物乳酸和氨，以及一些非必需氨基酸如丙氨酸，脯氨酸。其中，乳酸和氨是兩種主要代謝廢物，其積累可影響細胞生長以及產品質量。減少這兩種代謝產物的積累，是大規模細胞培養技術研究的重要方向。

氨是由谷氨酰胺和天冬酰胺產生的。限制培養基中谷氨酰胺的含量亦是減少氨生成的常用方法。

除了以上與細胞生長有關的物質以外，培養基中一般還要加入酚紅（當溶液酸性時pH小于6.8呈黃色；當溶液堿性時pH大于8.4呈紅色），一種pH指示劑。

在較為復雜的培養液中還包括核酸降解物(如嘌呤和嘧啶兩類)以及氧化還原劑(如谷胱甘肽)等。有的培養液還直接采用了三磷酸腺苷和輔酶A。

二、常用細胞培養基

(1)MEM細胞培養基系列

(2)DMEM細胞培養基系列

(3)RPMI-1640細胞培養基系列

(4)199細胞培養基系列

(5)水解乳蛋白細胞培養基

(6)歐氏平衡鹽

(7)F-10,F-12細胞培養基系列

(8)其它類型細胞培養基

三、干粉培養基的配制

配制培養基要注意以下問題：

認真閱讀說明書。說明書都注明干粉不包含的成分，常見的有NaHCO₃、谷氨酰胺、丙酮酸鈉、HEPES等。這些成分有些是必須添加的，如NaHCO₃、谷氨酰胺，有些根據實驗需要決定。

配制是要保證充分溶解，NaHCO₃、谷氨酰胺等物質都要等培養基*溶解之后才能添加。

配制所用的水應是三蒸水，離子濃度很低。

所用器皿應嚴格消毒。

配制好的培養基應馬上過濾，無菌保存于4度。

液體培養基主要是為了科研工作的方便而設計的培養基，它是一種滅菌后保證無菌的溶液，必要時可制成無內毒素等的溶液，可節省科研人員的工作量。

配制方法

在一個盡可能接近總體積的容器中加入比預期培養基總體積少5％的雙蒸水。

在室溫（20℃到30℃）的水中加入干粉培養基，輕輕攪拌，不要加熱。

水洗包裝袋的內部，轉移全部的痕量干粉到容器內。

加NaHCO₃到培養基中。

用雙蒸水稀釋到想要的體積，攪拌溶解。注意不要過分攪拌。

通過緩慢攪拌加入1N NaOH 或1N HCL調節pH值，由于pH值在過濾時會上升0.1到0.3，因而調節pH值使它比zui終想要的pH值低0.2到0.3。培養基在過濾前要保持密封。

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