實(shí)驗(yàn)步驟    

基 本 方 案 1 多克隆抗磷酸肽抗體的制備

材料

B S A -瓊 脂 糖 親 和 基 質(zhì)（Sigma) 填 裝（如輔助方案 2 ) 于柱床體積IOml的層析柱

磷酸化酪氨酸親和基質(zhì)層析柱（IOml 柱床體積；見輔助方案3)

磷酸肽-B S A 偶聯(lián)物免疫家兔的粗制血清

PB S /疊氮鈉.•含有0.02% (m /V ) 疊氮 鈉 的 PBS (附 錄 1 ) ( 可長(zhǎng)期保存于4°C 或室溫）

3m ol/L NaSCN

同種非磷酸肽親和基質(zhì)層析柱（3m l 柱床體積；見輔助方案1 和 2)

同源磷酸肽親和基質(zhì)層析柱（可選； 3m l 柱床體積；見輔助方案1 和 2)

陽(yáng)性選擇的磷酸肽親和基質(zhì)層析柱（3m l 柱床體積；見輔助方案1 和 2)

3.5m ol/L 和 4. 5m ol/L MgCl2 (可選）

透 析 袋（M W C O 12 000?14 0 0 0 ; 寬 10m m ，直徑 6. 4m m ; 如 Spectrum 的 Spectra/Por 4)

注 ：所有以下的層析步驟均在室溫下進(jìn)行，液體均以重力作用上柱。

1 . 將洗滌后的B S A -瓊脂糖與磷酸酪氨酸親和基質(zhì)層析柱相連。

2 . 將 15m l 的粗制血清通過重力作用流過兩柱，以 PBS/疊氮鈉洗，直到所有黃色血清均 通 過 層 析 柱（或以分光光度計(jì)測(cè)流出液的A 28。吸光度，直至達(dá)到基線）。再 以 5?IOml P B S /疊氮鈉洗柱，收集所有穿出液，其中可能含有目的抗體。

每 一 次 過 柱 后 血 清 的 體 積 會(huì) 增 加 ， 這 將 延 長(zhǎng) 下 一 次 過 柱 的 時(shí) 間 。 如 果 通 過 觀 察血 清 的 黃 色 程 度 來 確 定 液 體 流 穿 的 進(jìn) 程 ， 則 血 清 越 被 稀 釋 后 就 越 不 容 易 觀 察 。

3 . 可選：留取部分粗制血清組分及*次的穿出液，用于后續(xù)分析及對(duì)比每一次純化的組分。如果有必要，可立即通過免疫印跡對(duì)含有多種磷酸化酪氨酸蛋白的樣本進(jìn)行 分 析（單 元 12. 5)，以排除無反應(yīng)的組分。也可以留取部分純化的組分用于接下來的分析，然后繼續(xù)下一步驟。

4 . 血清過柱后，以 1 0 倍柱床體積的3mol/L N a S C N 和 10倍柱床體積的P B S /疊氮鈉再生柱子， 4°C 保 存 于 P B S /疊氮鈉中備用。

5 . 將穿出的血清組分盡量多次過同種非磷酸肽親和基質(zhì)柱，以盡量減少交叉反應(yīng)。以10倍柱床體積的3mol/L N a S C N 和 1 0 倍柱床體積的PBS/疊氮鈉再生柱子。分析每次或多次過柱的血清或保留部分組分待以后分析。

6 . 如果預(yù)期與同源的磷酸蛋白有交叉反應(yīng)，則 使 用 步 驟 5 中提供的方法使穿出的血清組分通過同源磷酸肽親和基質(zhì)柱。

7 . 在收集陽(yáng)性選擇親和純化的穿出峰之前，將 25c m 的透析袋水化并洗滌。透析袋一端用透析夾夾緊，檢查是否滲漏，配 制 6L PBS/疊氮化合物， 4°C 保存用作透析液。

8 . 將上次層析步驟所得到的流穿血清通過陽(yáng)性選擇的磷酸肽親和基質(zhì)柱3 次（使抗體親和基質(zhì)的相互作用zui大化），在每次之間不需洗柱。

9 . 收集zui后一次穿出的血清，用 5?20m l 的 P B S /疊 氮 鈉 洗 柱（根據(jù)柱前體積和柱床體積），將洗滌物與流穿的血清合并，另 用 20m l 的 P BS/疊氮鈉洗柱，收集流穿液體作為 「洗滌」峰 。

10.以多種促溶劑洗脫：可 以 選 用 20m l 3mol/LNaSCN (*選擇）或 10m l 3.5mol/LMgCl2 (可能會(huì)產(chǎn)生沉淀，減慢流速）洗脫后加I O m U .5mol/L MgCl2洗脫。開始洗脫時(shí)，立即收集每份3m l 洗脫液到步驟7 中準(zhǔn)備的透析袋中，用透析夾將近端的袋口夾緊并立即投入PBS/疊氮鈉透析液中?；蛘咭部梢允占?m l 洗脫液到透析管中，一旦收集每一組分完畢，立即將透析液加人透析管中。收集至少6 個(gè) 組 分（大多數(shù)抗體在前 3 個(gè)組分中， 2?3 個(gè)柱床體積），如前所述再生柱子（步 驟 4)。

11.在 P B S /疊氮鈉中于4°C 對(duì) 步 驟 1 0 收集的所有組分進(jìn)行*透析。

12.檢 測(cè) 280n m 吸光度或用蛋白比色法測(cè)定透析后組分的蛋白質(zhì)濃度，并 計(jì) 算 產(chǎn) 量（15 ml血清得到> l m g 純化抗體）。分裝抗體保存于一70°C ，正在使用的抗體保存于4°C 。

13.用 ELISA (單元L I ) 或 免 疫 印 跡（單 元 12. 5 ) 分析zui終樣本以及以前步驟中保存的純化組分的反應(yīng)性和交叉反應(yīng)性。

基 本 方 案 2 制備抗磷酸肽的單克隆抗體

材 料（帶V 項(xiàng) 目 見 附 錄 1)

融合后的候選雜交瘤細(xì)胞系（單 元 1.3)

D M E M /H T *培養(yǎng)基

篩選稀釋液

同種磷酸肽-B S A 偶 聯(lián) 物（作 為 E L I S A 抗原；輔助方案1 和 單 元 13. 1、單 元 13. 3)

陰性對(duì)照：用于制備雜交瘤細(xì)胞系小鼠的免疫前血清

陽(yáng)性對(duì)照：用于制備雜交瘤細(xì)胞系小鼠的免疫血清

同種非磷酸酪氨酰基肽-B S A 偶 聯(lián) 物（作 為 E L I S A 抗 原 ；單 元 13.1、單 元 13.3)

非同種磷酸酪氨酰基肽-B S A 偶 聯(lián) 物（作 為 E L IS A 抗原 ；單 元 13.1、 單 元 13. 3)

B S A 偶聯(lián)的同源磷酸肽（可選；作 為 E L IS A 抗原；單 元 13.1、 單 元 13. 3)

9 6 孔聚苯乙烯組織培養(yǎng)板

網(wǎng)格記錄紙

1 . 用 H T 培養(yǎng)基將融合的候選雜交瘤細(xì)胞系以低密度（目的是達(dá)到每3 個(gè) 孔 1 個(gè)細(xì)胞）接 種 于 9 6 孔聚苯乙烯組織培養(yǎng)板（單 元 1.3)， 2 周左右測(cè)定，通 過 記 錄 9 6 個(gè)網(wǎng)格記錄紙上每個(gè)孔上的克隆數(shù)目來鑒定所有單克隆雜交瘤培養(yǎng)孔，作為可能的候選株，為便于鑒別，在每個(gè)含有單個(gè)克隆的孔的下方做標(biāo)記。

2 . 使用無菌技術(shù)，從每個(gè)可能候選株的孔中移出等份上清（如 從 2 0 0 4 中 移 出 IOOm I)至另一個(gè)9 6 孔 板（篩選板）中，在網(wǎng)格記錄紙上記錄原始板的編號(hào)、孔的位置以及相對(duì)應(yīng)板的編號(hào)、孔的位置。原始孔每孔再補(bǔ)加以100ul， 37°C 預(yù)熱的新鮮H T 培養(yǎng)基 。如果需要，用亮色的孔狀大小的膠貼粘貼在板蓋表面以示標(biāo)記。如果上清沒有立即進(jìn)行檢測(cè)，則將篩選板塑料袋包好存放于4°C 。

3 . 篩選板中每孔上清液加入150ul 篩 選 稀 釋 液（防止微生物污染并擴(kuò)大體積）。

4 . 以同種非磷酸肽-B S A 偶聯(lián)物為抗原進(jìn)行ELISA (單 元 1.1)，對(duì)篩選板中每一候選雜交瘤上清的部分組分（如 50M1 ) 進(jìn)行篩選。記錄每個(gè)陽(yáng)性樣本篩選板的編號(hào)、孔的位置以及相對(duì)應(yīng)的原始板編號(hào)、孔 的 位 置 ，同時(shí)測(cè)定融合用小鼠的免疫前血清(陰性對(duì)照）和 同 一 只 小 鼠 的 免 疫 血 清（陽(yáng)性對(duì)照），在 H T 培 養(yǎng) 基 ：篩選稀釋液1 : 1 混合液中按1 : 1 0 0 稀釋 。同時(shí)也對(duì)空白篩選稀釋液進(jìn)行E L I S A 檢 測(cè)（作為附加的陰性對(duì)照）

。

5 . 以同種非磷酸肽-B S A 偶聯(lián)物為抗原，順次或同時(shí)對(duì)步驟4 篩選出的每個(gè)陽(yáng)性樣本的部分組分進(jìn)行ELISA (單 元 1 . 1 ) 檢 測(cè) ，以剔除非磷酸化反應(yīng)性的克??；以非同種無關(guān)磷酸酪氨酰基肽-B S A 偶聯(lián)物為抗原進(jìn)行 E L IS A 檢 測(cè) ，以剔除具有其他磷酸酪氨酸反應(yīng)性的克隆。此外，如果預(yù)期可能與同源磷酸化蛋白有交叉反應(yīng)，則 以 BSA偶聯(lián)的同源磷酸肽為抗原以剔出任何可能的同源磷酸化蛋白交叉反應(yīng)。如果有必要，也可以同時(shí)篩選具有非磷酸化同種肽的特異反應(yīng)性的克隆。

6 . 將克隆擴(kuò)大培養(yǎng)，以滿足篩選所需的所有試驗(yàn)。冷凍部分組分備用。通過有限稀釋(單 元 1 . 3 ) 對(duì)剩余的細(xì)胞進(jìn)行亞克隆。

7 . 如 步 驟 4 和 5 , 篩選亞克隆的上清，檢測(cè)抗體的持續(xù)分泌和特異性。將具有代表性的獨(dú)立亞克隆與其原始的母代克隆區(qū)分開來，因?yàn)殡y以預(yù)測(cè)每個(gè)母代單克隆抗體是否能夠識(shí)別同種磷酸化全蛋白，或者能否用于日后的各種類型免疫檢測(cè)。擴(kuò)大培養(yǎng)和凍存候選亞克隆。經(jīng)過多輪傳代和凍存、復(fù)蘇、再擴(kuò)大培養(yǎng)后，連續(xù)檢測(cè)抗體的特異性和分泌持續(xù)性（推薦）。

8 . 進(jìn)一步對(duì)亞克隆進(jìn)行鑒定，選取zui有用的克隆，分析培養(yǎng)上清液在特定的免疫檢測(cè)(如免疫共沉淀，如 單 元 12. 2 中所述；或免疫印跡，如 單 元 12. 5 中所述）中與同種磷酸化全蛋白的反應(yīng)性。

9 . 可選：將目的克隆大量培養(yǎng)獲取培養(yǎng)上清制備抗體，并 進(jìn) 行 親 和 純 化（見基本方案1)，或 制 備 腹 水（單 元 1.4)，腹水可通過硫酸銨沉淀而后進(jìn)行親和純化。如果有必要 ，可以利用商業(yè)化的試劑盒（如 Pierce或 Sigma) 進(jìn)行亞型分析。

輔 助 方 案 1 肽的合成

目前，大多數(shù)含磷酸酪氨酰基的肽是利用9-芴 甲 氧 羰 基（Fmoc) 磷酸酪氨酸合成的。由于在磷酸酪氨酸上缺乏一個(gè)側(cè)鏈保護(hù)性基團(tuán)（Kitas^ d . ， 1994)，標(biāo) 準(zhǔn) F m o c 合成和裂解步驟才得以應(yīng)用（Chang and Meienhofer， 1978); 然 而 ，要想達(dá)到氨基酸的有效偶聯(lián)，在加入未保護(hù)的磷酸酪氨酸后，需要比標(biāo)準(zhǔn)步驟用量更高的超濃度的活化F m o c 氨基酸。在有些情況下，需要用雙偶聯(lián)法，即在加入磷酸酪氨酸之后再加入少量其他氨基酸以延長(zhǎng)肽鏈。這種替代方法需要按合成肽的要求，有順序地、反復(fù)加入下一個(gè)氨基酸。在本單元中闡述將肽偶聯(lián)到親和基質(zhì)上的方法（見 輔 助 方 案 2)，將肽段偶聯(lián)到載體蛋白的常用方法將在單元13. 1 和單 元 13. 3 中闡述。

輔 助 方 案 2 肽 段 偶 聯(lián) 到Affi-G d 1 0 親和性基質(zhì)

此方案描述了將磷酸肽和非磷酸肽偶聯(lián)到Affi-Gel 1 0 親和性基質(zhì)上的方法，用于抗體的親和柱層析純化。這一步驟可生成3m l 終末柱床體積的親和性樹脂，每毫升凝膠 偶 聯(lián) 3umol肽 。

材料

用于偶聯(lián)的合成寡肽（見輔助方案1)

二 甲 基 亞 砜（D M S O )

iV-甲 基 嗎 啉（9 9 % 純度； AcrosOrganics)

Affi-Gd 10 (Bio-Rad) 或類似活化支持基質(zhì)

氨基乙醇

0.lmol/L 氨基 乙 醇 •H C 1， p H 8. 0

高鹽/髙 p H 溶液••0 •5mol/L NaCl/0. 4 % (m A O 碳酸氫鈉

高鹽/低 p H 溶液： 0.5mol/L N a C l /100 mmol/L 乙酸鈉， p H 4.2

PB S /疊氮鈉：含 有 0.02% (m /V ) 疊氮鈉的PBS (附錄1)

0.5mol/L NaCl

3mol/L NaSCN

聚丙烯螺旋蓋離心管

直 立 圓 筒（end-over-end) 搖床

真空吸引器

玻璃層析柱，容量> 5 ml (Bio-Rad) ，或 帶 有 1-cc硅 化 玻 璃 棉 塞 子 的 5m l 塑料注射器

1 . 將 合 成 寡 肽 按 0.5?4 倍 所 需 柱 床 體 積 的 容 量 比 溶 解 于 D M S O 。例 如 ， 9 Mm o l 肽(15. 3m g ，對(duì)于一個(gè)平均15m e r 分子質(zhì)量為1700的肽）對(duì) 應(yīng) 3m l 柱床體積。

2 . 按如下操作小心滴定以中和肽溶液：以 1?2ul增量加入肽合成級(jí)N -甲基對(duì)氧氮己環(huán)(高濃度或在D M S O 中稀釋到1 : 1 ?1 : 9 ) ，每次加入后移出 2?3ul等 份 ，將其用50ul水稀釋，然后點(diǎn)在 p H 試紙條上。重復(fù)這一步驟，直 到 p H 達(dá) 到 7?8 (基本上每 3 umol肽 需 要 7?8ul，取決于氨基酸序列）

3 . 充分混勻 Affi-Gd 1 0 親和性基質(zhì)瓶中的內(nèi)容物，使樹脂懸浮，然后將所需體積的樹脂[2 倍 于 柱 體 積（4 倍 于 5 0 % 混 懸 物）的 樹 脂 ] 移 至 聚 丙 烯 螺 旋 蓋 離 心 管 ，在D M S O 中 洗 3 次 ，每次在室溫下以700 g 轉(zhuǎn) 速 離 心 5 min。吸出上清液，以 5 倍體積D M S O 重懸樹脂，然后再次以700 g 轉(zhuǎn)速離心。不要超過推薦的轉(zhuǎn)速進(jìn)行離心，否則可能破壞樹脂。

4 . 從樹脂中吸出過量的D M S O , 加 入 步 驟 2 制備好的肽溶液，在室溫下用直立圓筒振蕩器孵育。每 毫 升 樹 脂 加 入 純 氨 基 乙 醇（消除未反應(yīng)的酯基團(tuán)），在室溫下用直立圓筒搖床孵育2 h ，如 步 驟 3 在 D M S O 中洗 2 次 。

5 . 如 步 驟 3 在 p H 8. 0 的 0. lmol/L氨 基 乙 醇 •H C l 中 洗 2 次（第 1 次要在冰上進(jìn)行，因?yàn)闀?huì)產(chǎn)生大量熱量），第 2 次洗滌后移出O.lmol/L氨 基 乙 醇 ^ H C l , 更換新溶液，在 4°C 下用直立圓筒搖床孵育，然后低速離心并吸出上清液。

6 . 利用步驟3 中描述的方法，用高鹽/高 p H 溶 液 洗 3 次 、高鹽/低 p H 溶 液 洗 3 次 、P BS /疊氮鈉洗3 次 ，洗滌后的樹脂保存于4°C ，直至裝于層析柱。

7 . 用 O.5mol/L N a C l 將基質(zhì)混合為混懸物，然后灌入玻璃層析柱或帶有1-cc硅化玻璃棉塞子的5m l 塑料注射器底部，先 后 用 1 0 倍 于柱體積的3m d / L N a S C N 和 1 0 倍于柱體積的P B S /疊氮鈉洗滌每個(gè)層析柱。

輔 助 方 案 3 磷 酸 酪 氨酸 偶 聯(lián)到Affi-G d 1 0 親和基質(zhì)

此步驟可生成IOml終末柱床體積的親和性樹脂，每毫 升 Affi-Gd 1 0 偶 聯(lián) 3 umol 磷酸酪氨酸。

材料

磷酸酪氨酸

0.4% (m /V ) 碳酸氫鈉

lmol/L N a O H (可選）

氨基乙醇

0 •lmol/L 氨 基 乙 醇 •H C 1， p H 8. O

燒結(jié)玻璃漏斗和真空吸引器

玻璃層析柱，容量> 1 4 ml (Bio-Rad)

1 . 將磷酸酪氨酸按 0.5?4 倍的預(yù)期柱床體積的容量比溶解于 0 . 4 % 碳酸氫鈉。例如 ，30umol 磷 酸 酪 氨 酸（7.8m g ，對(duì)于相對(duì)分子質(zhì)量為 2 6 1 的磷酸酪氨酸）對(duì) 應(yīng) IOml柱床體積。如果簡(jiǎn)便些，可以多用些磷酸酪氨酸，因?yàn)樗鄬?duì)比較便宜。

2 . 用 p H 試紙條測(cè)定 p H 達(dá) 到 7?8。如果有必要調(diào)整，可通過滴定來中和溶液，如加入 少 量 l m d /L N a O H ，每次加入后移出2?3jlJ 等份 ，然后點(diǎn)在p H 試紙條上。重復(fù)這一步驟直到 p H 達(dá) 到 7?8。

3 . 充分混勻Affi-Gel 1 0 親和基質(zhì)瓶中的內(nèi)容物，使樹脂懸浮，然后將所需體積的樹脂[2倍 于 柱 體 積（4 倍 于 5 0 % 混懸物）的樹脂]移至連接真空抽吸器的玻璃陶瓷漏斗。洗 3 次 ，每次向樹脂上灌入冷蒸餾水后進(jìn)行抽吸，然后以同樣方法用冰冷的 0 . 4 % 碳酸氫鈉洗滌zui后一次。

4 . 用真空抽吸從凝膠中吸出大部分多余的液體，不必使其*干燥，將其移至螺旋帽離心管，加入步驟 2 備好的磷酸酪氨酸溶液，樹 脂 從 瓶 中 移 出（步 驟 3 ) 到與磷酸酪氨酸溶液混合的時(shí)間間隔不要超過 20min。在 4°C 下用直立圓筒搖床孵育。

5 . 每毫升樹脂加入 2ul 純 氨 基 乙 醇（消除未反應(yīng)的酯基團(tuán)），在室溫下用直立圓筒振蕩器 孵 育 2 h 。洗樹 脂 2 次 ，每 次 低 速 離 心（見輔助方案2 , 步 驟 3 ) 并吸出上清液，以5 倍 體 積 0 . 4 % 碳酸氫鈉重懸樹脂，然后再次低速離心。

6 . 如 步 驟 4 在 p H 8. 0 的 0. lmol/L 氨 基 乙 醇 •H C l 中 洗 2 次 ，第 2 次洗滌后移出0.lmol/L 氨 基 乙 醇 . H C l ，更換新溶液，在 4°C 下用直立圓筒搖床孵育，然后低速離心并吸出上清液。洗滌 、保存、填 裝 樹 脂 于 層 析 柱 中（見 輔 助 方 案 2 , 步驟

7)。