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中級(jí)會(huì)員 | 第2年

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生化試劑
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半胱an酸(cysteine, Cys)含量測(cè)定試劑盒說(shuō)明書

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半胱an酸(cysteine, Cys含量測(cè)定試劑盒說(shuō)明書

微量法 100T/96S

正式測(cè)定前務(wù)必取 2-3 個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定測(cè)定意義:

蛋白質(zhì)含有三種含硫an基酸:甲硫an酸、胱an酸Cys。其中,Cys 是wei一一種含有巰基的含硫an酸,從甲硫an酸轉(zhuǎn)化而來(lái),并且可與胱an酸互相轉(zhuǎn)化。Cys 參與蛋白質(zhì)二硫鍵的形成,經(jīng)常是蛋白質(zhì)活性中心的組成部分,還可以為其它生理生化反應(yīng)提供巰基。此外,Cys 大量積聚在皮膚和粘膜表面,在角dan白生成中維持重要的巰基酶的活性,并且補(bǔ)充巰基,以維持皮膚的正常代謝,調(diào)節(jié)表皮最下層的色素細(xì)胞生成的底層黑se素。具有美白、解毒、改善炎癥和過(guò)敏性皮膚等作用。

測(cè)定原理:

Cys 還原磷鎢酸生成鎢藍(lán),在 600nm 處有吸收峰;通過(guò) 600nm 吸光度,計(jì)算Cys 含量。

組成:

 

產(chǎn)品名稱

BH6014-100T/96S

Storage

試劑一:液體

1

4℃

試劑二:液體

1

4℃

試劑三:粉劑

1

4℃

標(biāo)準(zhǔn)品:粉劑

1

4避光

說(shuō)明書

1 

 

試劑三用前 1 天,向試劑三中加 2.5ml 蒸餾水充分溶解,再加 85%磷酸 0.625ml,混勻后蓋緊(防止水分散失)沸水浴 2h;冷卻后加 10ml 蒸餾水,4℃可保存 2 周。

標(biāo)準(zhǔn)品臨用前加 10 ml 蒸餾水,充分溶解。1μmol/ml 標(biāo)準(zhǔn)液,4℃避光保存。用不完的試劑 4℃可保存 3 天。

自備儀器和用品:

低溫離心機(jī)、可調(diào)式移液槍、可見(jiàn)分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96 孔板、85%磷酸和蒸餾水。

半胱氨酸提取:

1. 液體樣品中半胱氨酸提取:取 0.1ml 液體樣品,加試劑一 0.9ml,充分混勻,8000g

4℃離心 10min,取上清液,待測(cè)。

2. 組織中半胱氨酸提取:按照組織質(zhì)量(g):試劑一體積(ml) 15~10 的比例(建議稱取約 0.1g組織,加入 1ml 試劑一)進(jìn)行冰浴勻漿,8000g 4℃離心 10 min,取上清液待測(cè)。

3. 細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞:先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi),離心后棄上清;按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量(104 個(gè)):試劑一體積(ml 500~10001 的比例(建議 500 萬(wàn)細(xì)菌或細(xì)胞加入 1ml 試劑一),超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞(冰浴,功率 20%或 200W,超聲 3s,間隔 10s,重復(fù) 30 次);8000g 4℃離心 10min,取上清,置冰上待測(cè)。

測(cè)定步驟:

1. 分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱 30 min,調(diào)節(jié)波長(zhǎng)到 600 nm,蒸餾水調(diào)零。

2. 空白管:取微量石英比色皿/96 孔板,加入 20μl 蒸餾水,100μl 試劑二,100μl 試劑三,混勻后室溫靜置 15 min,于 600nm 處測(cè)定吸光值,記為 A 空白管。

3. 標(biāo)準(zhǔn)管:取微量石英比色皿/96 孔板,加入 20μl 標(biāo)準(zhǔn)液,100μl 試劑二,100μl 試劑三,混勻后室溫靜置 15 min,于 600nm 處測(cè)定吸光值,記為 A 標(biāo)準(zhǔn)管。

4. 測(cè)定管:取微量石英比色皿/96 孔板,加入 20μl 上清液,100μl 試劑二,100μl 試劑三,混勻后室溫靜置 15 min,于 600nm 處測(cè)定吸光值,記為 A 測(cè)定管。

注意:空白管和標(biāo)準(zhǔn)管只需要做一次。

計(jì)算公式:

a. 使用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下

1. 按液體樣品的體積計(jì)算:

半胱氨酸含量(μmol/ml=[C 標(biāo)準(zhǔn)品×V 標(biāo)準(zhǔn)品×(A 測(cè)定管-A 空白管)÷(A 標(biāo)準(zhǔn)管-A 空白管)]×V樣總÷V 樣)=1×(A 測(cè)定管-A 空白管)÷(A 標(biāo)準(zhǔn)管-A 空白管)

2. 按樣本質(zhì)量計(jì)算:

半胱氨酸含量(μmol/g 鮮重)=[C 標(biāo)準(zhǔn)品×V 標(biāo)準(zhǔn)品×(A 測(cè)定管-A 空白管)÷(A 標(biāo)準(zhǔn)管-A 空白管)]×

V 樣總÷V 樣)÷W=1×(A 測(cè)定管-A 空白管)÷(A 標(biāo)準(zhǔn)管-A 空白管) ÷W

3. 按照蛋白濃度計(jì)算:

半胱氨酸含量μmol /mg prot= [C 標(biāo)準(zhǔn)品×V 標(biāo)準(zhǔn)品×(A 測(cè)定管-A 空白管)÷(A 標(biāo)準(zhǔn)管-A 空白管)]÷

V ×Cpr=1×(A 測(cè)定管-A 空白管)÷(A 標(biāo)準(zhǔn)管-A 空白管) ÷Cpr

4. 按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算:

氨基酸含量(μmol /104 cell=[C 標(biāo)準(zhǔn)品×V 標(biāo)準(zhǔn)品×(A 測(cè)定管-A 空白管)÷(A 標(biāo)準(zhǔn)管-A 空白管)] ×

V 樣總÷V ×細(xì)胞數(shù)量)=1×(A 測(cè)定管-A 空白管)÷(A 標(biāo)準(zhǔn)管-A 空白管) ÷細(xì)胞數(shù)量

C 標(biāo)準(zhǔn)品:標(biāo)準(zhǔn)品濃度,1 μmol/mlV 標(biāo)準(zhǔn)品:反應(yīng)體系中加入標(biāo)準(zhǔn)品體積,0.02mlV 樣:反應(yīng)體系中加入樣品提取液體積,0.02 mlV 樣總:樣品提取液,1mlW:樣品質(zhì)量,g

b. 使用 96 孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下

1. 按液體樣品的體積計(jì)算:

半胱氨酸含量(μmol/ml=[C 標(biāo)準(zhǔn)品×V 標(biāo)準(zhǔn)品×(A 測(cè)定管-A 空白管)÷(A 標(biāo)準(zhǔn)管-A 空白管)]×V樣總÷V 樣)=1×(A 測(cè)定管-A 空白管)÷(A 標(biāo)準(zhǔn)管-A 空白管)

2. 按質(zhì)量計(jì)算:

半胱氨酸含量(μmol/g 鮮重)=[C 標(biāo)準(zhǔn)品×V 標(biāo)準(zhǔn)品×(A 測(cè)定管-A 空白管)÷(A 標(biāo)準(zhǔn)管-A 空白管)]×

V 樣總÷V 樣)÷W=1×(A 測(cè)定管-A 空白管)÷(A 標(biāo)準(zhǔn)管-A 空白管) ÷W

3. 按照蛋白濃度計(jì)算:

半胱氨酸含量μmol /mg prot= [C 標(biāo)準(zhǔn)品×V 標(biāo)準(zhǔn)品×(A 測(cè)定管-A 空白管)÷(A 標(biāo)準(zhǔn)管-A 空白管)]÷

V ×Cpr=1×(A 測(cè)定管-A 空白管)÷(A 標(biāo)準(zhǔn)管-A 空白管) ÷Cpr

4. 按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算:

氨基酸含量(μmol /104 cell=[C 標(biāo)準(zhǔn)品×V 標(biāo)準(zhǔn)品×(A 測(cè)定管-A 空白管)÷(A 標(biāo)準(zhǔn)管-A 空白管)] ×

V 樣總÷V ×細(xì)胞數(shù)量)=1×(A 測(cè)定管-A 空白管)÷(A 標(biāo)準(zhǔn)管-A 空白管) ÷細(xì)胞數(shù)量

C 標(biāo)準(zhǔn)品:標(biāo)準(zhǔn)品濃度,1 μmol/mlV 標(biāo)準(zhǔn)品:反應(yīng)體系中加入標(biāo)準(zhǔn)品體積,0.02mlV 樣:反應(yīng)體系中加入樣品提取液體積,0.02 mlV 樣總:樣品提取液,1mlW:樣品質(zhì)量,g

注意事項(xiàng):

*低檢限為 100μmol/L

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