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生化試劑
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吡咯啉-5-羧酸合成酶(P5CS)試劑盒說明書

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吡咯啉-5-羧酸合成酶(P5CS試劑盒說明書

分光光度法 50 /24 

正式測定前務必取 2-3 個預期差異較大的樣本做預測定測定意義:

脯氨酸是植物體內適應逆境脅迫的一種重要的滲透調節物質。高等植物中脯氨酸代謝因其初始底物不同,分為谷氨酸( Glu) 和鳥氨酸( Orn) 兩條合成途徑。

吡咯啉-5-羧酸合成酶(P5CS,Δ1-pyrroline-5-carboxylate synthetase)是以谷氨酸為前體合成脯氨酸途徑的關鍵酶,對植物適應逆境脅迫起關鍵作用。

測定原理:

吡咯啉-5-羧酸合成酶催化谷氨酸生成 P5C 過程中分解ATP 生成ADP 和無機磷,通過鉬酸銨比色法測定單位時間內產生無機磷的量可確定P5CS 活性。

組成:

 

產品名稱

BH6017-50T/24S

Storage

試劑一:液體

60ml

4℃

試劑二:液體

6ml

4℃

試劑三:液體

6ml

4℃

試劑四:粉劑

1 

4℃

試劑五:粉劑

1 

4℃

試劑六:液體

25ml

RT

試劑七:10mmol/L 標準磷貯備液

10ml

4℃

說明書

1

 

試劑四用時加入 25 ml 蒸餾水,溶解后 4℃保存一周;試劑五用時加入 25 ml 蒸餾水,溶解后 4℃保存一周;

0.5μmol/ml 標準磷應用液配制:

將試劑七 20 倍稀釋,即取 0.1ml 試劑七加 1.9ml 蒸餾水充分混勻。

定磷劑的配制:

H2O: 試劑四:試劑五:試劑六=2:1:1:1 的比例配制,配好的定磷劑應為淺黃色。若無色則試劑失效,若是藍色則為磷污染,定磷劑現用現配。

注意:配試劑最好用新的燒杯、玻棒和玻璃移液器,也可以用一次性塑料器皿,避免磷污染。

自備儀器和用品:

可見外分光光度計、臺式離心機、水浴鍋、可調式移液器、1ml 玻璃比色皿、研缽、冰和蒸餾水。

樣品酶液的制備:

1、組織樣品:按照組織質量(g):試劑一體積(ml) 15~10 的比例(建議稱取約 0.1g 組織,加入

1ml 試劑一),進行冰浴勻漿。8000g 4℃離心 10min,取上清,置冰上待測。

2、血清(漿)樣品:直接檢測。

操作步驟:

1、分光光度計或酶標儀預熱 30min 以上,調節波長至 660nm。

2、酶促反應(EP 管中加入下列試劑


對照管

測定管

試劑二μl


100

樣本μl


100

混勻,37℃(哺乳動物) 25℃(其他物種)準確水浴 10min

 

試劑三μl

100

100

試劑二μl

100


樣本μl

100


混勻,8000g,25℃離心 10min,取上清液

3、定磷(EP 管或 96 孔板中加入下列試劑


空白管

標準管

對照管

測定管

0.5μmol/ml 標準磷應用液μl


100



上清液μl



100

100

蒸餾水μl

100




定磷試劑μl

1000

1000

1000

1000

混勻,室溫放置 30min,在 660nm 處,記錄各管吸光值。

 

注意:

1、由于每一個樣都必須做對照,本試劑盒 50 管保證測 24 P5CS 活性。

2、此法具有微量、靈敏、快速的特點。所以對測定所用試管要求嚴格無磷。

3、空白管和標準管只要做一管。每個測定管設一個對照管。

計算

1、血清(漿)P5CS 活力的計算:

單位定義:每小時每毫升血清(漿)P5CS 消耗ATP 產生 1μmol 無機磷的量為一個酶活力單位。

P5CS 活力(μmol/h/ml=C 標準管×A 測定管-A 對照管)÷A 標準管-A 空白管)×V ÷V ÷T=9

×A 測定管-A 對照管)÷A 標準管-A 空白管

2、組織中P5CS 活力的計算:

(1) 按蛋白濃度計算:

單位定義:每小時每毫克組織蛋白中 P5CS 消耗ATP 產生 1μmol 無機磷的量為一個酶活力單位。

P5CS 活力(μmol/h /mg prot)=C 標準管×A 測定管-A 對照管)÷A 標準管-A 空白管)×V ÷Cpr×V樣)÷T =9 ×A 測定管-A 對照管)÷A 標準管-A 空白管)÷Cpr

(2) 按樣本鮮重計算:

單位定義:每小時每克組織中 P5CS 消耗ATP 產生 1μmol 無機磷的量為一個酶活力單位。

P5CS 活力(μmol/h /g 鮮重)=C 標準管×A 測定管-A 對照管)÷A 標準管-A 空白管)×V ÷(W× V

÷V 樣總)÷T=9 ×A 測定管-A 對照管)÷A 標準管-A 空白管÷W

 

C 標準管:標準管濃度,0.5μmol/mlV 總:酶促反應總體積,0.3mlV 樣:加入樣本體積,0.1ml  V 樣總:加入提取液體積,1ml;T:反應時間,1/6 小時;Cpr:樣本蛋白質濃度,mg/ml;W:樣本鮮重, g。


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