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鳥an酸轉氨酶(nithine-δ-aminotransferase ,δ-OAT)試劑盒說明書

時間:2025/1/9閱讀:487
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鳥氨酸轉氨酶(nithine-δ-aminotransferase ,δ-OAT)試劑盒說明書

微量法 100T/96S

正式測定前務必取 2-3 個預期差異較大的樣本做預測定測定意義:

脯氨酸是植物體內適應逆境脅迫的一種重要的滲透調節物質。高等植物中脯氨酸代謝因其初始底物不同,分為谷氨酸( Glu) 和鳥氨酸( Orn) 兩條合成途徑。鳥氨酸轉氨酶( δ-OAT) 是以鳥氨酸為前體合成脯氨酸途徑的關鍵酶,對植物適應逆境脅迫起關鍵作用。

測定原理:

鳥氨酸和α-酮戊二酸在鳥氨酸轉氨酶和 NADH 作用下發生氨基轉移反應生成吡咯啉-5-羧酸(P5C),同時產生NAD,通過檢測 340nm 處的吸光度的變化可反映鳥氨酸轉氨酶活性的高低。

組成:

 

產品名稱

BH6016-100T/96S

Storage

提取液:液體

110ml

4

試劑一:液體

30ml

4

試劑二:粉劑

1 

4

試劑三:粉劑

1 

4

試劑四:粉劑

2 

-20

說明書

1

 

試劑二臨用前加 8ml 試劑一充分溶解;用不完的試劑 4℃保存。試劑三臨用前加 8ml 試劑一充分溶解;用不完的試劑 4℃保存。試劑四臨用前每瓶加 4ml 試劑一充分溶解;現配現用。

自備儀器和用品:

天平、低溫離心機、研缽、酶標儀、96 孔板。

酶液提取:

1、組織:按照質量(g):提取液體積(ml) 15~10 的比例(建議稱取約 0.1g,加入 1ml 提取液)加入提取液,冰浴勻漿后于 4℃,10000g 離心 10min,取上清置冰上待測。

2、細胞:按照細胞數量(104 個):提取液體積(ml 500~10001 的比例(建議 500 萬細胞加入1ml 提取液),冰浴超聲波破碎細胞(功率 300w,超聲 3 秒,間隔 7 秒,總時間 3min;然后 4℃,10000g離心 10min,取上清置冰上待測。 3、液體:直接檢測。

測定操作:

1、酶標儀預熱 30min,調節波長至 340nm

2、將配好的試劑二、三、四 37℃預熱 5min。(注意:粉劑試劑需要自行配制

3、取 96 孔板,依次加入 60μl 試劑二,60μl 試劑三,60μl 試劑四,20μl 粗酶液,充分混勻,記錄 340nm

處初始吸光值和 37℃反應 10min 的吸光值A2A=A1-A2

計算公式:

96 孔板測定的計算公式如下

(1) 按照樣本蛋白濃度計算

酶活單位定義:每毫克組織蛋白每分鐘消耗 1 nmol NADH 定義為一個酶活力單位。 δ-OATnmol/min /mg prot=ΔA÷(ε×d×V 反總÷(V ×Cpr) ÷T

=321.54×ΔA÷Cpr

(2) 按照樣本質量計算

酶活單位定義:每克組織每分鐘消耗 1 nmol NADH 定義為一個酶活力單位。 δ-OATnmol/min /g 鮮重)=ΔA÷(ε×d×V 反總÷(W ×V ÷V 樣總) ÷T

=321.54×ΔA÷W

(3) 按照細胞數量計算

酶活單位定義:每 104 個細胞每分鐘消耗 1 nmol NADH 定義為一個酶活力單位。 δ-OATnmol/min /104 cell= ΔA÷(ε×d×V 反總÷(V ×細胞數量÷V 樣總) ÷T

=321.54×ΔA÷細胞數量

(4) 按照液體體積計算

酶活單位定義:每毫升液體每分鐘消耗 1 nmol NADH 定義為一個酶活力單位。 δ-OATnmol/min /ml)=ΔA÷(ε×d×V 反總÷V ÷T

=321.54×ΔA

V 反總:反應體系總體積,0.2mlε:NADH 摩爾消光系數,6.22×103 L / mol /cmd96 孔板光徑, 0.5cmV 樣:加入樣本體積,0.02mlV 樣總:加入提取液體積,1mlT:反應時間,10 minCpr:樣本蛋白質濃度,mg/mlW:樣本質量,g


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