概覽

實驗設計

2.1 mRNA-LNP的體外評估方法：

1. 未攝取 mRNA（Cy5（-）/EGFP（-）
2. 空白（即預期無細胞的象限）（Cy5（-）/EGFP（+）
3. 已攝取了 mRNA 但尚未翻譯（Cy5(+) / EGFP(-)）
4. 這兩種細胞都攝取了 mRNA 并將其翻譯成了蛋白質（Cy5(+) / EGFP(+)）。
   

2.2 機制研究方法：

實驗步驟

1. 向 96 孔板中加入 100 μL濃度為每 100 μL 1×10? 個細胞的 HepG2 細胞。在 37°C、5%二氧化碳培養箱中孵育過夜，使細胞附著于培養板底。

2. 用 HepG2 細胞培養基（含 10%胎牛血清和 1%青霉素 - 鏈霉素的 DMEM 培養基）將 FLuc mRNA LNPs 稀釋至最終濃度為 500 ng/mL。

3. 陽性對照包括裸mRNA 或 Lipofectamine 2000 與 mRNA 的復合物。

將 1 mg/ml的FLuc mRNA 用 HepG2 細胞培養基稀釋至 500 ng/ml。制備Lipofectamine 2000 mRNA 對照：在 0.6 ml的試管中，加入 5μL Lipofectamine 2000 于 25 μL的 Opti-MEM 培養基中。在另一個 0.6 ml的試管中，加入 5 μL 1 mg/ml的裸露 FLuc mRNA 于 25 μL的 Opti-MEM 培養基中。將上述溶液混合，在室溫下孵育 5 分鐘。用 HepG2 細胞培養基將溶液稀釋至最終濃度為 500 ng/ml。

4. 陰性細胞活性對照：在 HepG2 細胞培養基中稀釋 Triton X-100 以獲得 1%（體積比）的 Triton，作為陰性活性對照，以確保檢測準確運行。

5. 使用 2 ml的移液器將第1步中 96 孔板中的 HepG2 細胞培養基吸出并丟棄。

6. 向三個孔（A4 - C4）中加入 100 μL 500 ng/ml的來自步驟2的FLuc mRNA LNP，向八個孔（A2 - H2）中加入 100 μL新鮮的 HepG2 細胞培養基（作為 100% 細胞活性對照），向三個孔（A6 - C6）中加入 100 μL 500 ng/ml的裸 FLuc mRNA，向三個孔（F12 - H12）中加入 100 μL 1%的 Triton。在 37°C、5% CO2 培養箱中孵育 24 小時。

7. 進行 alamarBlue 細胞活性測定，在一個 15 ml的試管中，將 1 ml的 alamarBlue 細胞活性試劑加入到 9 ml的細胞培養基中（1：10）。

8. 使用 2 ml的吸液管將第6步中 96 孔板上的上清液吸出并丟棄。

9. 將步驟7中稀釋的 alamarBlue 溶液倒入 25 ml的試劑儲存器中。

10. 使用多通道移液器向步驟8中制備的平板的每個孔中加入 100 μL的 alamarBlue 溶液。

11. 將 96 孔板轉移至 5%二氧化碳培養箱中，在 37°C 下孵育 2 至 4 小時。

12. 在酶標儀中讀取 570 納米處的吸光度和 600 納米處的背景值。

13. 計算細胞活性

14. 在另一塊 96 孔板中，重復步驟1至6。向每個處理過的孔中加入 100 μL Bright-Glo 熒光素酶檢測緩沖液。孵育 3 分鐘，然后在微孔板讀數儀上讀取發光值。

第 2 部分：定量評估熒光標記LNP的細胞攝取情況

關鍵信息：在 mRNA 脂質納米顆粒配方中加入了 Atto-488 DOPE 分子（步驟 16）。

15. 用 HepG2 細胞培養基將細胞懸液稀釋至每 100 μL 2×10? 個細胞的最終濃度。在 24 孔板的每個孔中加入 400 μL細胞。每個孔的最終細胞密度應為 8×10? 個細胞。在 37°C、5% CO? 培養箱中孵育過夜，以使細胞附著于基質。

16. 使用 Atto-488 DOPE 制備 Atto-488 標記的FLuc mRNA-LNP。用細胞培養基將 Atto-488 標記的 FLuc mRNA LNPs 稀釋至最終濃度為 500 ng/mL。

17. 用 2 ml的吸液管將 24 孔板中的上清液吸出并丟棄。

18. 每孔向細胞中加入 400 μL 500 ng/ml的 Atto-488 標記的FLuc mRNA LNP。向其他細胞中加入 400 μL新鮮細胞培養基（作為未染色細胞對照）。在 37°C、5%二氧化碳培養箱中孵育 24 小時。

19. 用 DPBS 洗滌細胞三次，每次向每個孔中加入 400 μL DPBS。孵育 10 秒，然后用2 ml吸液管吸取上清液并丟棄液體。

20. 用 150 μL 2 倍濃度的胰蛋白酶 - EDTA（10 倍濃度胰蛋白酶 - EDTA 的 1:5 稀釋液）使細胞分離，并在 5%二氧化碳培養箱中孵育 5 分鐘。

21. 一旦所有細胞從培養板上脫落，向每個孔中加入 200 μL DPBS，然后將每個孔中的細胞轉移到單獨的 1.7 ml管中。

22. 用 DPBS 洗滌細胞兩次，每次向每管中加入 400 μL DPBS，然后以 300g 離心 5 分鐘，棄去上清液。每次洗滌后，將細胞懸浮于 200 μL DPBS 中。

23. 在流式細胞儀（如 Attune NxT 流式細胞儀）上分析樣本。將前向散射光（FSC）電壓設為 100，側向散射光（SSC）電壓設為 280，并根據需要進行調整，以確保能清晰觀察到單細胞簇。然后選擇“BL1"通道來測量樣本。

23. 使用 FlowJo（或類似）軟件，通過與未處理細胞對照相比具有更強熒光強度的細胞百分比或通過幾何熒光平均強度來評估 Atto-488 標記的 FLuc mRNA LNPs 的攝取情況。

第 3 部分：使用熒光標記的LNP 的細胞攝取和蛋白質表達定量評估

關鍵在信息：將 Cy5-EGFP mRNA 封裝到所需的 LNP 配方中，該配方由可離子化脂質（SM-102）、磷脂（DOPE）、膽固醇和 PEG 脂質（C14-PEG-2000）以及 Cy5-EGFP mRNA 組成，制備方法參考上期內容。

25. 在 24 孔板中，重復步驟15至22。使用流式細胞儀（如 Attune NxT 流式細胞儀）分析樣本。將前向散射光（FSC）電壓設為 100，側向散射光（SSC）電壓設為 280，并根據需要進行調整，以確保能清晰觀察到單細胞簇。然后選擇“BL1"通道和“RL1"通道來測量樣本。使用 FlowJo 軟件，通過將樣本分為四個象限，以對照未處理細胞中熒光強度更強的細胞百分比來評估 Cy5-EGFP mRNA LNP 的攝取和表達情況。

26. 計數 HepG2 細胞數量，然后用 HepG2 細胞培養基稀釋細胞懸液，使最終濃度為每 100 μL 1×104 個細胞。向每孔加入 300 μL細胞，使最終細胞密度為每孔 3×104 個細胞（在 µ-slide 8 孔蓋玻片載玻片中）。在 37°C、5% CO2 培養箱中孵育過夜，以使細胞附著于基質。

27. 用細胞培養基稀釋 Cy5-EGFP mRNA LNP，使其最終濃度為 500 ng/mL。

28. 用 2 ml的抽吸移液管通過真空抽吸將 µ-slide 8 孔蓋玻片載玻片上的上清液吸出并丟棄。

29. 向每個孔中加入 300 μL 500 ng/ml的 Cy5-EGFP mRNA 脂質納米顆粒。在 5%二氧化碳培養箱中 37℃孵育 24 小時。

30. 用 DPBS 洗滌細胞兩次，每次向每個孔中加入 300 μL DPBS。

31. 在 15 ml的試管中，用 DPBS 將 10 mg/ml的 Hoechst 33342 稀釋至 1 μg/ml。向每個孔中加入 300 μL  1μg/ml的 Hoechst 33342，然后在 37°C、5%二氧化碳培養箱中孵育 10 分鐘。

32. 重復步驟30，將細胞清洗三次。

33. 向每個孔中加入 200 μL的 DPBS。

34. 通過將 µ-slide 8 孔蓋玻片置于共聚焦激光掃描顯微鏡下進行共聚焦顯微鏡活細胞成像，以觀察 mRNA LNP 的水平（選擇“Cy5"通道）和 EGFP 表達（選擇“EGFP"通道）。使用 WCIF Image J 軟件處理圖像，添加比例尺并合并不同通道（藍色代表細胞核，紅色代表 Cy5-mRNA，綠色代表 EGFP 蛋白）。

第4部分：內體逃逸機制研究

關鍵信息：為了量化細胞內 mRNA-LNP的內體逃逸能力，有必要在 LNPs 上添加一些熒光標記。使用 Atto-488 標記的 FLuc mRNA-LNP。

35. 重復步驟 26。

36. 重復步驟 16。

37. 重復步驟 28。

38. 向每個孔中加入 300 μL 500 ng/ml的 Atto-488 標記的熒光素酶 mRNA 脂質納米顆粒。在 37°C、5%二氧化碳培養箱中孵育 4 小時。

39. 重復步驟 30。

40. 在 15 ml的試管中，用細胞培養基將溶酶體示蹤劑深紅色稀釋至最終濃度為 100 nM。

關鍵步驟：將細胞培養基預熱至 37 攝氏度。

41. 向每個細胞孔中加入 300 μL 100 nM的稀釋型溶酶體示蹤劑深紅色溶液，然后在 37 攝氏度、5%二氧化碳培養箱中孵育 1 小時。

42. 重復步驟 30。

43. 在 15 ml的試管中，用 DPBS 將 10 mg/ml的 Hoechst 33342 稀釋至 1 μg/ml。向每個孔中加入 300 μL 1 μg/ml的 Hoechst 33342，然后在 37°C、5%二氧化碳培養箱中孵育 10 分鐘。

44. 重復步驟 30。

45. 向每個孔中加入 200 μL的 DPBS。

46. 通過將 µ-slide 8 孔蓋玻片置于共聚焦激光掃描顯微鏡下進行活細胞成像，以可視化內體（選擇“Lysotracker Deep Red"通道）、細胞核（選擇“Hoechst 33342"通道）和 Atto-488 標記的 FLuc mRNA LNPs（選擇“Atto-488"通道）。需要拍攝五張具有代表性的細胞圖像（每張圖像包含超過 20 個細胞）來計算 PCC 值。這些圖像可以通過 WCIF Image J 軟件進一步處理，以添加比例尺并合并不同通道（藍色：細胞核；紅色：內體；綠色：Atto-488 標記的 FLuc mRNA LNPs）。要獲取 PCC 值，請將共聚焦圖像導入帶有“JACoP"插件的 WCIF ImageJ 軟件。導航至“插件"，選擇“JACoP"，然后選擇“皮爾遜相關系數"。選擇圖像 A（綠色通道）和圖像 B（紅色通道），然后點擊“分析"。軟件將計算 PCC 值。內體逃逸能力通過 PCC 進行量化，其中 PCC 值為 1 表示無內體逃逸，而 PCC 值為 0 表示充分內體逃逸。

第5部分：使用巴弗洛霉素 A1 評估質子海綿機制

關鍵信息：為了量化細胞內 mRNA-LNP的內體逃逸能力，有必要在 LNPs 上添加一些熒光標記。使用 Atto-488 標記的 FLuc mRNA-LNP。

47.重復步驟35至37，但在步驟36中，按照實驗步驟制備未標記熒光素的 FLuc mRNA LNP。

48. 向三個孔中加入 180 μL新鮮的 HepG2 細胞培養基，向另外三個孔中加入含有巴弗洛霉素 A1（111.1 nM）的新鮮 HepG2 細胞培養基。

49. 在 1.7 ml的試管中，稱取 1.5 mg的鈣黃綠素，然后加入 1 ml的磷酸鹽緩沖鹽水（DPBS），使鈣黃綠素的最終濃度為 1.5 mg/ml。

50. 向每個孔中加入 20 μL 1.5 mg/ml的鈣黃綠素，以獲得 150 μg/ml的鈣黃綠素和 100 nM的巴弗洛霉素 A1 的最終濃度。

51. 向每個孔中加入 100 μL 1500 ng/ml的 mRNA 脂質納米顆粒（以獲得最終濃度為 500 ng/ml的 mRNA 脂質納米顆粒）。向對照細胞中加入 100 μL新鮮培養基。在 37°C、5%二氧化碳培養箱中孵育 4 小時。

52. 在 4 小時的孵育期結束后，用戶可選擇用 CellMask™ Deep Red Actin 跟蹤染料（方案 A）對細胞骨架進行染色，或用 Hoechst 33342（方案 B）對細胞核進行染色，以分別觀察細胞骨架和細胞核。

（A）染色細胞骨架

（i）在 15 ml的試管中，用細胞培養基將 CellMask™ Deep Red Actin 跟蹤染料（1 毫摩爾）稀釋至最終濃度為 1 微摩爾。

（ii）向每個處理過的孔中加入 300 μL 1 微摩爾的稀釋 CellMask™ Deep Red Actin 跟蹤染料。

（iii）在 5% CO2 培養箱中 37°C 孵育 15 分鐘。

（B）染色細胞核

（i）用 Hoechst 33342 染色細胞核，請重復步驟 54。

53. 用 DPBS 洗滌細胞四次，重復步驟30。

54. 向每個孔中加入 200 μL的 DPBS。

55. 通過將 µ-slide 8 孔蓋玻片置于共聚焦激光掃描顯微鏡下進行活細胞成像，以共聚焦顯微鏡觀察鈣黃綠素信號（選擇“鈣黃綠素"通道）、細胞核（選擇“Hoechst 33342"通道）和細胞骨架（選擇“CellMask Deep Red"通道）。圖像可通過 WCIF Image J 軟件進一步處理，以添加比例尺或合并不同通道（藍色：細胞核；紅色：細胞骨架；綠色：鈣黃綠素）。

預期結果

在HepG2 細胞的 FLuc 表達評估中，所有 mRNA LNPs 的耐受性均如預期般良好（圖3a），1%的 Triton X-100 使細胞存活率低于 10%，這表明 alamarBlue 細胞活力測定法有效。在蛋白質表達方面，ATP LNPs 的 FLuc 表達量高于其他配方，而 TAT LNPs 和八精氨酸 LNPs 的 FLuc 表達量較低（圖3b）。為了評估細胞攝取情況，利用 Atto-488 標記的 DOPE制備LNP ，并量化與培養基處理對照組相比熒光信號增強的細胞百分比。TAT LNPs、八精氨酸 LNPs 和 TA LNPs 的細胞攝取量低于 LNP 組（圖3c）。將 Cy5-EGFP mRNA 封裝到 LNP ，蛋白質表達和細胞攝取可通過流式細胞術進行定量評估（圖3d、e），所得結果與圖3b、c 中的結果相似。通過這種方法，可以同時評估蛋白質表達和細胞攝取。為了定性評估蛋白質表達和細胞攝取，可使用共聚焦顯微鏡可視化 Cy5-EGFP mRNA LNPs，為研究人員提供更直觀、直接的 mRNA LNPs 效果評估方式。如圖3f 所示，ATP LNPs 表現出更高的蛋白質表達，而 TAT LNPs、八精氨酸 LNPs 和 TA LNPs 則表現出較低的蛋白質表達，這與圖3d、e 中的結果一致。

參考文獻：Ma Y, VanKeulen-Miller R, Fenton OS. mRNA lipid nanoparticle formulation, characterization and evaluation. Nat Protoc. 2025 Mar 11. doi: 10.1038/s41596-024-01134-4. Epub ahead of print. PMID: 40069324.