脂質納米顆粒（LNPs）作為RNA的臨床先進遞送系統，已在癌癥治療、蛋白質替代療法、自身免疫性疾病治療以及冠狀病毒傳染病等傳染病的mRNA疫苗中展現出巨大潛力。然而，LNPs在遞送過程中面臨的一個主要生物學障礙是內體逃逸效率低，通常低于10%。盡管離子化脂質在酸性內體環境中能夠促進膜融合，但天然存在的磷脂如DSPC和DOPE的功能尚未被充分理解，且很少有研究通過化學工程手段改善其功能性。本研究旨在設計一種新型兩性離子磷脂，通過誘導立方相的形成，提高LNPs的內體逃逸效率，從而改善mRNA的功能性遞送。
材料與方法
1.1 材料：
DOPE-Cx系列磷脂通過邁克爾加成反應合成。CL4F6作為一種pH敏感的陽離子脂質，用于構建LNPs。其他試劑如DSPC、DOPE、POPC、PEG-DMG等均購自商業供應商。- LNPs的制備：采用微流控混合技術，將含有CL4F6、磷脂、膽固醇和PEG-DMG的乙醇溶液與含有mRNA的醋酸鹽緩沖液混合，制備LNPs。通過透析和超濾步驟純化LNPs。
- LNPs的表征：使用動態光散射（DLS）測量LNPs的粒徑、多分散指數（PDI）和ζ電位。通過核磁共振磷譜（31P NMR）和小角X射線散射（SAXS）分析脂質相行為。
- 體內實驗：采用BALB/c小鼠模型，通過尾靜脈注射LNPs，評估mRNA在肝臟中的表達水平。使用生物發光成像系統（IVIS）監測LNPs在體內的分布。
Figure 1. Strategy and structure of DOPE-Cx.結果與討論
體內mRNA表達水平評估：為了評估DOPE-Cx磷脂對mRNA遞送效率的影響，我們制備了含有不同磷脂（DSPC、DOPE、以及一系列DOPE-Cx變體）的脂質納米顆粒（LNPs），并通過尾靜脈注射到BALB/c小鼠體內。6小時后，收集小鼠肝臟組織，通過熒光素酶（Fluc）活性檢測來評估mRNA的表達水平。
- DSPC與DOPE對照組：與含有DSPC的LNPs相比，含有DOPE的LNPs并未顯著提高mRNA的表達水平，這表明單純替換DSPC為DOPE并不能有效改善mRNA的遞送效率。
- DOPE-Cx變體：引人注目的是，含有DOPE-Cx變體（特別是DOPE-C6、C8和C10）的LNPs顯著提高了mRNA在肝臟中的表達水平。其中，DOPE-C8表現出最高的mRNA表達水平，相較于DSPC對照組，其Fluc活性提高了數倍。
- 鏈長依賴性：進一步的研究發現，DOPE-Cx磷脂的疏水鏈長度對mRNA表達水平有顯著影響。較短的疏水鏈（如C4和C6）和較長的疏水鏈（如C12和C18:1）均未能達到與DOPE-C8相當的表達水平，表明存在一個最佳的疏水鏈長度范圍。
Figure 2. Impact that the chemical structure of DOPE-Cx exerts on the hepatic delivery of mRNA.EGFP表達驗證：為了驗證mRNA序列的獨立性，我們還制備了含有增強型綠色熒光蛋白（EGFP）編碼mRNA的LNPs，并觀察了其在肝臟組織中的表達情況。與Fluc表達結果一致，含有DOPE-C8的LNPs顯著誘導了EGFP在肝臟中的表達，進一步證實了DOPE-Cx磷脂在提高mRNA遞送效率方面的有效性。細胞類型鑒定：通過免疫熒光染色，我們發現mRNA主要在肝細胞中表達，這表明DOPE-Cx磷脂能夠有效地將mRNA遞送至目標細胞類型。31P NMR分析：為了深入理解DOPE-Cx磷脂如何影響LNPs的脂質相行為，我們采用了31P核磁共振（NMR）技術。將DOPE-Cx磷脂與磷脂酰膽堿（POPC）以不同摩爾比混合，并制備成脂質懸浮液進行NMR分析。
Figure 3. Analysis of the lipid phase of DOPE-Cx lipid mixed with POPC.
SAXS與Cryo-TEM驗證：為了進一步驗證DOPE-Cx磷脂誘導立方相的形成，我們采用了小角X射線散射（SAXS）和冷凍透射電子顯微鏡（Cryo-TEM）技術。
為了評估DOPE-Cx磷脂在體內的代謝情況，我們采用了液相色譜-質譜聯用（LC/MS）技術。在注射含有DOPE-C8的LNPs后不同時間點收集小鼠肝臟組織，并測定DOPE-C8的濃度。結果顯示，DOPE-C8在肝臟中的濃度迅速下降，半衰期較短（約1.83小時），表明其不易在體內積累。此外，通過血清穩定性實驗發現，DOPE-C8在血清中容易被酯酶降解，生成無毒的代謝產物。這些詳細的實驗結果充分證明了DOPE-Cx磷脂在提高mRNA遞送效率方面的有效性，并展示了其在體內的安全性和良好的代謝特性。
Figure 4. Characterization of DOPE-C8-LNPs.
結論
本研究成功設計并合成了一種新型立方相誘導的兩性離子磷脂DOPE-Cx，通過誘導立方相的形成，顯著提高了LNPs在肝臟中的mRNA遞送效率。此外，DOPE-Cx在體內表現出良好的安全性和代謝特性，為mRNA治療應用提供了新的策略。未來的研究將進一步探索DOPE-Cx在其他組織中的遞送效率，并優化其化學結構以提高功能性。參考文獻：Iwakawa, Kazuki, et al. "Cubic Phase‐Inducible Zwitterionic Phospholipids Improve the Functional Delivery of mRNA." Advanced Science (2025): 2413016.
