材料與方法

實驗設計：本研究使用雌性BALB/c小鼠作為實驗模型，通過肌肉注射給予LNP、LNP-mRNA或生理鹽水作為對照。在注射后不同時間點（2小時、16小時和40小時）收集注射部位肌肉組織，進行單細胞RNA測序分析。

單細胞RNA測序：使用10x Genomics平臺進行單細胞RNA測序，構建注射部位肌肉組織的單細胞轉錄組圖譜。通過差異基因表達分析、主成分分析（PCA）和細胞間相互作用網絡分析等方法，系統解析mRNA疫苗在注射部位誘導的免疫反應。

功能驗證：通過ELISA、IFN-γ ELISpot和流式細胞術等方法，驗證IFN-β在mRNA疫苗誘導的細胞免疫應答中的作用。

實驗結果

2.1 注射部位免疫反應的主要軸：

通過主成分分析（PCA），我們對mRNA疫苗在注射部位誘導的免疫反應進行了系統性解析。結果顯示，這些免疫反應主要分為兩個軸：

• PC1軸：代表由脂質納米顆粒（LNP）成分驅動的基質細胞炎癥反應。這一軸的反應在空LNP（不含mRNA成分的LNP）和LNP-mRNA注射后均顯著增強，表明LNP本身具有強大的佐劑效應，能夠誘導基質細胞（如成纖維細胞、內皮細胞和壁細胞）產生炎癥反應。

• PC2軸：代表由mRNA成分驅動的樹突狀細胞（DCs）I型干擾素（IFN）反應。這一軸的反應特異性地出現在LNP-mRNA注射后，而在空LNP注射后未觀察到顯著變化。這表明mRNA成分在注射部位能夠特異性地誘導DCs產生I型IFN反應。

2.2 mRNA在注射部位成纖維細胞中的富集：

通過單細胞RNA測序分析，我們詳細剖析了mRNA疫苗在注射部位各細胞類型中的分布情況。結果顯示，mRNA疫苗中的mRNA在注射部位成纖維細胞中高度富集。特別是在注射后16小時，成纖維細胞中的mRNA含量顯著高于其他細胞類型。

進一步的分析還表明，成纖維細胞在注射mRNA疫苗后表達IFN-β基因（Ifnb1），且這種表達特異性地由mRNA成分誘導。空LNP注射后的成纖維細胞中未檢測到Ifnb1的表達，進一步證實了mRNA成分在誘導IFN-β表達中的特異性作用。

2.3 IFN-β在細胞免疫應答中的作用：

為了驗證IFN-β在mRNA疫苗誘導的細胞免疫應答中的作用，我們進行了一系列功能驗證實驗。首先，我們通過ELISA檢測了注射部位肌肉組織和血清中的IFN-β水平，發現LNP-mRNA注射后IFN-β水平顯著升高，而空LNP注射后則未觀察到顯著變化。

接下來，我們通過IFN-γ ELISpot實驗評估了不同免疫策略下小鼠的抗原特異性細胞免疫應答。結果顯示，在LNP+亞單位疫苗免疫策略中，共注射IFN-β顯著增強了抗原特異性細胞免疫應答。相反，在LNP+mRNA疫苗免疫策略中，由于內源性IFN-β的產生已經達到飽和水平，共注射IFN-β并未進一步增強細胞免疫應答。

為了進一步驗證IFN-β在細胞免疫應答中的作用，我們還使用了IFN-β中和抗體進行阻斷實驗。結果顯示，在LNP+mRNA疫苗免疫策略中，注射部位IFN-β信號的阻斷顯著降低了抗原特異性CD8+ T細胞應答。這些結果共同表明，注射部位的IFN-β在mRNA疫苗誘導的細胞免疫應答中發揮了關鍵作用。

除了上述發現外，我們還對注射部位成纖維細胞的動態變化進行了深入分析。通過軌跡分析，我們發現空LNP注射后，成纖維細胞群體發生了顯著變化，出現了Fib_Cxcl5和Fib_Ccl19兩種炎癥性成纖維細胞亞群。這些亞群高表達多種趨化因子基因，能夠招募免疫細胞到注射部位。

進一步的分析還表明，Fib_Cxcl5和Fib_Ccl19亞群的出現依賴于LNP成分，而mRNA成分則主要誘導成纖維細胞表達IFN-β基因。這些發現進一步強調了LNP和mRNA作為mRNA疫苗兩大組分在誘導注射部位免疫反應中的不同作用。

2.5.1 DC的IFN-β響應：

為了追蹤mDC_ISGs的命運，我們還對dLNs進行了單細胞RNA測序分析。結果顯示，mDC_ISGs細胞群也存在于dLNs中，并且同樣高表達IFN響應特征。這表明mDC_ISGs細胞不僅在注射部位產生，還能夠遷移到dLNs，可能在適應性細胞免疫應答的起源中發揮作用。

2.5.3 IFN-β對DCs功能的影響：

討論

本研究創新性的系統解析了mRNA疫苗在注射部位誘導的免疫反應，并揭示了IFN-β在促進細胞免疫應答中的關鍵作用。我們發現，mRNA疫苗中的mRNA成分特異性地在注射部位成纖維細胞中誘導IFN-β表達，進而激活DCs的I型IFN反應，最終促進抗原特異性細胞免疫應答。

此外，本研究還強調了LNP和mRNA作為mRNA疫苗兩大組分的不同免疫佐劑效應。LNP成分主要通過誘導基質細胞炎癥反應發揮佐劑作用，而mRNA成分則通過誘導IFN-β表達促進細胞免疫應答。這一發現為優化mRNA疫苗設計提供了新的思路。

本研究通過單細胞轉錄組學分析，深入探討了mRNA疫苗在注射部位的早期免疫反應，特別是IFN-β在促進細胞免疫應答中的作用。我們的研究不僅增進了對mRNA疫苗免疫機制的理解，還為開發更高效、更安全的mRNA疫苗提供了科學依據。

參考文獻：Kim, Seongryong, et al. "Innate immune responses against mRNA vaccine promote cellular immunity through IFN-β at the injection site." Nature Communications 15.1 (2024): 7226.