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靶向CRISPR-Cas9脂質納米顆粒在頭頸癌中的治療性基因組編輯

時間:2025/3/13閱讀:223
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“本研究介紹了一種安全有效的頭頸癌(HNSCC)瘤內表皮生長因子受體(EGFR)靶向的CRISPR-脂質納米顆粒(LNP)遞送策略,用于共封裝CRISPR-Cas9信使核糖核酸(mRNA)和單導向核糖核酸(sgRNA),以實現SOX2基因的敲除。我們生成了功能性靶向LNPs(tLNPs),它們共封裝Cas9 mRNA與靶向SOX2的sgRNA,并涂覆有抗EGFR抗體。我們評估了它們在HNSCC癌細胞中的攝取和表達,以及體內外的治療效果。結果顯示,這些tLNPs能夠特異性地靶向腫瘤細胞,誘導持久的治療反應,為臨床上高復發率的實體瘤如HNSCC提供了一種有前景的治療方法。"




01


實驗結果


1.1 sgRNA篩選與基因編輯效率:


在本研究中,我們針對SOX2基因設計了三種sgRNA(sgSOX2-A、-B、-C),并在具有不同頭頸癌原發起源的HNSCC細胞系(UMSCC-104和FADU)中進行了篩選。通過轉染Cas9蛋白和針對SOX2的sgRNA(形成核糖核蛋白/RNP復合物)后,比較基因編輯效率。
Sanger測序和ICE分析結果顯示,sgSOX2-A在UMSCC-104細胞系中實現了58%的體外基因編輯,在FADU細胞系中實現了40%的基因編輯。因此,sgSOX2-A被選為進一步體內和體外實驗的最佳導向RNA。


靶向CRISPR-Cas9脂質納米顆粒在頭頸癌中的治療性基因組編輯


圖一、sgRNA的體外篩選和細胞活性檢測


1.2 基因編輯對細胞活性的影響:


為了評估基因編輯對細胞活性的影響,我們對轉染了sgSOX2-RNP的UMSCC104和Fadu HN-SCC細胞進行了XTT增殖實驗。同時,使用Turbo-GFP和YAP1 sgRNA作為對照。YAP1是一個誘導癌癥干細胞特性的轉錄因子,在HNSCC中過表達,與SOX2類似,因此被用作高效和高表達編輯的對照。實驗結果表明,SOX2基因編輯顯著降低了HNSCC細胞的活性。


靶向CRISPR-Cas9脂質納米顆粒在頭頸癌中的治療性基因組編輯


圖二、基因編輯對細胞活性的影響和編輯效率評估


1.3 靶向LNP的表征與基因編輯效率:


我們成功制備了靶向LNPs(tLNPs),并通過透射電子顯微鏡進行了表征。結果顯示,tLNPs具有適當的直徑、多分散性指數(PDI)和ζ電位,表明其具有良好的穩定性和分散性。為了確認tLNPs的基因編輯效率,我們進行了基因編輯分析。結果顯示,單次治療tLNPs后,SOX2位點實現了約17%的基因編輯。


靶向CRISPR-Cas9脂質納米顆粒在頭頸癌中的治療性基因組編輯


圖三、靶向LNP的理化性質評價和編輯效率評價


1.4 生物分布與安全性評估:


在體內實驗中,我們評估了tLNPs的生物分布。結果顯示,tLNPs能夠特異性地靶向HNSCC腫瘤,并實現高效的SOX2基因敲除。同時,我們分析了脾臟和肝臟細胞的基因編輯百分比,以確認是否存在脫靶編輯。結果顯示,未發現脫靶編輯。此外,我們還評估了tLNPs的免疫原性和毒性。結果顯示,SOX2-cLNPs無毒性或免疫原性。


靶向CRISPR-Cas9脂質納米顆粒在頭頸癌中的治療性基因組編輯


圖四、靶向LNP的體內攝取、分布和表達



1.5 靶向tLNPs在HNSCC小鼠模型中的治療效果:


為了探索靶向tLNPs在體內介導治療性基因編輯的能力,我們評估了其抑制HNSCC腫瘤生長的效果。我們使用異種移植HNSCC小鼠模型,通過瘤內注射靶向tLNPs。結果顯示,與未治療組相比,靶向tLNPs組實現了90%的腫瘤生長抑制和90%的生存率提高(>84天),且50%的小鼠腫瘤全部消失。這一結果表明,靶向tLNPs能夠高效、特異性地靶向HNSCC腫瘤,并實現持久的治療反應。


靶向CRISPR-Cas9脂質納米顆粒在頭頸癌中的治療性基因組編輯


圖五、靶向LNP的體內藥效評價

02


討論


本研究成功開發了針對頭頸癌的EGFR靶向CRISPR-LNP遞送策略,實現了SOX2基因的敲除,并評估了其治療效果。結果顯示,這些tLNPs能夠特異性地靶向腫瘤細胞,誘導持久的治療反應。這一策略為臨床上高復發率的實體瘤如HNSCC提供了一種有前景的治療方法。

然而,本研究仍存在一些局限性。例如,盡管tLNPs在HNSCC癌細胞中表現出良好的治療效果,但其在其他類型癌癥中的適用性尚需進一步驗證。此外,CRISPR-Cas9系統的脫靶效應也是一個需要關注的問題。在未來的研究中,我們將繼續優化tLNPs的制備和遞送策略,以降低脫靶效應并提高治療效率。



03


結論



本研究成功開發了針對頭頸癌的EGFR靶向CRISPR-LNP遞送策略,并評估了其治療效果。結果顯示,這些tLNPs能夠特異性地靶向腫瘤細胞并誘導持久的治療反應。這一策略為臨床上高復發率的實體瘤提供了一種有前景的治療方法,值得進一步研究和推廣。


參考文獻:Masarwy, Razan, et al. "Targeted CRISPR/Cas9 lipid nanoparticles elicits therapeutic genome editing in Head and Neck Cancer." Advanced Science (2024): 2411032.



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