“新冠病毒（SARS-CoV-2）mRNA脂質納米顆粒（LNP）疫苗的迅速獲批表明，mRNA LNP疫苗在應對緊急疫苗需求方面具有多功能性。然而，mRNA疫苗無法誘導黏膜細胞反應或對近期變異株產生廣泛保護。為了提高mRNA疫苗的交叉保護能力，本研究設計了一種新型mRNA LNP，其中共包載了編碼細胞因子佐劑和甲型流感血凝素（HA）抗原的mRNA結構，用于皮內接種。佐劑mRNA編碼一種新型融合細胞因子GIFT4，由粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子（GM-CSF）和白細胞介素-4（IL-4）組成。研究發現，佐劑型mRNA LNP疫苗可誘導針對異源流感抗原的高水平體液抗體和系統性T細胞反應，并保護免疫小鼠免受甲型流感病毒感染。
此外，該疫苗還在引流淋巴結中引發早期生發中心反應，并促進抗體分泌B細胞反應。本研究還生成了另一種編碼CCL27的佐劑mRNA，增強了系統性免疫反應。兩種佐劑mRNA均顯示出在小鼠中增強體液和細胞反應的有效佐劑作用。有趣的是，皮內接種GIFT4或CCL27 mRNA佐劑的mRNA LNP疫苗可誘導肺組織駐留T細胞。本研究表明，細胞因子mRNA可作為佐劑靈活配制到mRNA LNP疫苗中，以激發針對病毒變異的強烈免疫。"
圖一、GIFT融合蛋白（GM-CSF和IL-4）示意圖和mRNA/LNP示意圖
研究結果
1.1 GIFT4 mRNA佐劑增強的HA mRNA LNP疫苗誘導增強的體液免疫應答和保護效果：
在本研究中，我們評估了不同劑量（1μg、2μg或5μg）的GIFT4 mRNA作為佐劑的效果。結果顯示，與單獨使用HA mRNA LNP相比，GIFT4 mRNA佐劑增強的HA mRNA LNP在單次免疫后3周，能夠顯著刺激小鼠血清中產生更高的Aichi特異性IgG及IgG亞型（IgG1和IgG2a）抗體水平。這些結果表明，GIFT4 mRNA作為佐劑，能夠有效增強體液免疫應答。
接下來，我們評估了GIFT4 mRNA佐劑增強的LNP疫苗對同源A/Aichi病毒或異源A/Phi病毒致死性攻擊的保護效果。在加強免疫后4周，免疫小鼠通過鼻腔途徑分別接種5×LD50的同源A/Aichi病毒或3×LD50的異源A/Phi病毒。結果顯示，接種了HA+GIFT4 mRNA LNP疫苗的小鼠體重減輕程度較輕，且存活率達到了100%，而僅接種HA mRNA LNP疫苗的小鼠體重減輕程度適中，存活率為75%。未免疫的小鼠在兩種病毒感染后均表現出嚴重的致死性。這些結果表明，GIFT4 mRNA佐劑增強的LNP疫苗能夠為小鼠提供對同源和異源流感病毒致死性劑量的有效保護。
圖二、皮下注射GIFT mRNA佐劑LNP的抗體免疫反應
1.2 GIFT4 mRNA佐劑增強HA mRNA LNP疫苗改善T細胞免疫應答：
除了評估血清中的抗體應答外，對外周淋巴組織中的細胞免疫應答進行表征對于評估疫苗候選物的有效性也至關重要。我們進一步研究了抗原特異性T細胞應答。通過流式細胞術分析，我們發現GIFT4 mRNA佐劑增強的LNP疫苗能夠誘導更高水平的抗原特異性CD4+和CD8+T細胞應答，這些T細胞能夠分泌IFN-γ和IL-4等細胞因子，表明疫苗能夠同時激發Th1和Th2型免疫應答。
圖三、皮下注射GIFT mRNA佐劑LNP的細胞免疫反應
1.3 GIFT4 mRNA佐劑增強的HA mRNA LNP刺激強烈的B細胞免疫應答和早期生發中心應答：
為了評估GIFT4 mRNA佐劑增強的mRNA LNP對B細胞免疫應答的影響，我們在加強免疫后4周收集了脾臟細胞，并通過ELISpot檢測抗體分泌B細胞（ASCs）。與未免疫小鼠相比，接種了GIFT4 mRNA佐劑增強的LNP疫苗的小鼠脾臟中ASCs數量顯著增加。此外，我們還觀察到，在免疫后7天，引流淋巴結（ILNs）中GIFT4 mRNA佐劑增強免疫的小鼠B細胞中CD95+和CD95+GL7+細胞水平升高，這表明生發中心（GC）應答被早期激活。這些結果表明，GIFT4 mRNA佐劑能夠增強B細胞應答并促進早期生發中心反應。
圖四、皮下注射GIFT mRNA佐劑LNP的B細胞反應和早期生發中心免疫反應
1.4 CCL27 mRNA作為佐劑同樣增強體液和細胞免疫應答：
除了GIFT4 mRNA外，我們還測試了另一種細胞因子mRNA，即CCL27 mRNA作為佐劑的效果。結果顯示，CCL27 mRNA同樣能夠增強體液和細胞免疫應答，并表現出與GIFT4 mRNA相似的佐劑活性。在異源病毒抗原刺激下，CCL27 mRNA佐劑增強的LNP疫苗能夠誘導更高水平的交叉結合抗體和抗原特異性T細胞應答。
1.5 GIFT4或CCL27 mRNA佐劑增強的HA mRNA LNP皮內免疫誘導肺部T細胞免疫應答：
為了評估皮內接種mRNA LNP后肺部潛在的免疫應答，我們在加強免疫后4周犧牲了小鼠并收集了肺部樣本。結果顯示，與未免疫小鼠或僅接種HA mRNA LNP疫苗的小鼠相比，接種了GIFT4或CCL27 mRNA佐劑增強的LNP疫苗的小鼠肺部CD4+CD44+T細胞數量顯著增加。這些結果表明，皮內接種GIFT4或CCL27 mRNA佐劑增強的LNP疫苗能夠誘導肺部組織駐留T細胞應答，這對于防御呼吸道病原體至關重要。
圖五、皮下注射CCL27 mRNA佐劑LNP對細胞免疫和體液免疫反應的影響
圖六、皮下注射GIFT和CCL27 mRNA佐劑LNP對肺黏膜免疫反應和細胞免疫反應的作用
討論
本研究設計了一種新型mRNA LNP疫苗，其中共包載了編碼細胞因子佐劑和抗原的mRNA。通過皮內接種，該疫苗在小鼠中誘導了強烈的體液和細胞免疫應答，并顯示出對甲型流感病毒感染的廣泛保護作用。與單獨接種抗原mRNA的LNP疫苗相比，佐劑型疫苗在誘導抗體產生、增強T細胞反應以及保護小鼠免受病毒感染方面均表現出顯著優勢。本研究還表明，細胞因子mRNA作為佐劑具有靈活性，可根據所需的免疫效果和特定靶病原體進行適配。這種方法的可行性得到了最近關于新冠病毒感染 mRNA疫苗中使用mRNA編碼的IL-12/p70作為佐劑的研究結果的支持，進一步凸顯了細胞因子mRNA佐劑在提高疫苗效力方面的潛力。
參考文獻：Wei L, Zhu W, Dong C, et al. Lipid nanoparticles encapsulating both adjuvant and antigen mRNA improve influenza immune cross-protection in mice[J]. Biomaterials, 2025, 317: 123039.
