背景與挑戰

1.1 神經系統疾病的治療需求：

神經系統疾病是全球致殘的首要原因，也是第二大死亡原因。其中，中風和癡呆（包括阿爾茨海默病）是主要的致死原因之一。近年來，核酸療法（如mRNA蛋白替代療法或基因編輯療法）開始被探索用于治療神經系統疾病。例如，有研究使用血紅素加氧酶1（HO1）自復制mRNA治療缺血性中風，以及使用腦源性神經營養因子（BDNF）mRNA治療阿爾茨海默病。

1.2 血腦屏障的限制：

血腦屏障（BBB）是大腦的天然保護屏障，由腦毛細血管內皮細胞、基底膜、星形膠質細胞和周細胞組成。BBB阻止了約98%的小分子藥物和幾乎100%的大分子藥物進入大腦。因此，LNP必須穿越這一高度選擇性的屏障才能到達大腦。然而，目前缺乏高效遞送載體的原因之一是缺乏信息豐富的體外篩選平臺。

圖示靜脈給藥后LNP-RNA的體內分布

高通量篩選平臺的開發

2.1 HTS-BBB平臺的構建：

為了解決上述問題，Mike Mitchell Lab開發了一個用于高通量篩選mRNA LNP的血腦屏障轉運模型（HTS-BBB）。該模型建立在96孔Transwell板上，每個孔由生長在半透膜上的腦內皮單層組成，將頂室（代表血液側）和基底外側室（代表腦側）分開。這種設計允許同時評估LNP的轉染效率和跨單層的轉運效率。

圖1：血腦屏障（BBB）的生理學示意圖，以及高通量篩選血腦屏障平臺（HTS-BBB）的開發，該平臺用于識別能夠穿越并轉染血腦屏障、適用于神經系統疾病治療的mRNA脂質納米顆粒（mRNA LNPs）。

2.2 優化腦內皮單層細胞生長條件：

研究人員選擇了永生化人微血管腦內皮細胞（hCMEC/D3）作為細胞系，因為它們在1型膠原蛋白（BBB基底膜的關鍵成分）上生長時，能夠形成具有接觸抑制特性的單層細胞，并表達緊密連接和粘附連接，從而有助于調節BBB的結構完整性和滲透性。例如，在96孔Transwell板上，hCMEC/D3細胞以30000 cells/cm2的密度接種，6天后形成完整的單層。研究人員通過活/死成像技術監測細胞生長情況，并使用共聚焦顯微鏡分析單層的完整性。此外，研究人員還檢測了單層對FITC-葡聚糖的轉運能力，結果顯示10 kDa和70 kDa的FITC-葡聚糖的轉運率分別為5%和2%，表明單層具有高度的結構完整性和選擇性通透性。

2.3 優化轉染和轉運報告系統：

為了同時評估LNP的轉染和轉運效率，研究人員制備了含有熒光素酶（Luciferase）mRNA的LNP，并添加了1%的親脂性染料DiR。熒光素酶mRNA用于評估LNP的轉染效率，而DiR用于追蹤LNP的轉運。實驗結果顯示，Luciferase的發光信號比mCherry熒光信號更為靈敏。研究人員還發現，DiR的摩爾比對LNP的轉染能力有顯著影響，1%的DiR摩爾比是最核實條件。此外，研究人員還評估了不同處理時間對轉染效率的影響，發現24小時的信號強度顯著高于6小時，表明更長的處理時間有助于mRNA的翻譯。

實驗結果與驗證

為了驗證HTS-BBB平臺的預測性，研究人員將篩選出的LNP包封Luc-mRNA，按照0.3 mg/kg mRNA劑量靜脈注射到小鼠體內。檢測結果顯示，LNP4和LNP10在大腦中的熒光信號最高，其中LNP4的熒光信號強度超過LNP3的1000倍。此外，注射LNP4的小鼠大腦熒光強度占總熒光強度的1%，而注射LNP3的小鼠大腦熒光強度僅占0.2%。

研究意義與展望

總結

參考文獻：Han EL, Padilla MS, Palanki R, Kim D, Mrksich K, Li JJ, Tang S, Yoon IC, Mitchell MJ. Predictive High-Throughput Platform for Dual Screening of mRNA Lipid Nanoparticle Blood-Brain Barrier Transfection and Crossing. Nano Lett. 2024 Feb 7;24(5):1477-1486. doi: 10.1021/acs.nanolett.3c03509. Epub 2024 Jan 23. PMID: 38259198.