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【DNA 電泳】教你做果凍:瓊脂糖凝膠電泳實驗技巧分享

時間:2021/8/26閱讀:4327
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果凍晶瑩剔透,口感 QQ 的,其實果凍的原料瓊脂糖,也是我們平時用來跑電泳的材料,瓊脂糖凝膠電泳實驗常用以 DNA 切膠回收,DNA 分離和用于佐證 DNA 是否重組、質粒等是否切開。今天我們就來聊聊瓊脂糖凝膠電泳實驗的一些小技巧小細節。


【DNA 電泳】教你做果凍:瓊脂糖凝膠電泳實驗技巧分享


第一步:膠液的制備 

稱取 0.4g 瓊脂糖,置于 200ml 錐形瓶中,加入 50ml 0.5×TBE 稀釋緩沖液,放入微波爐里加熱,直到瓊脂糖全部熔化,取出搖勻,此為 0.8%瓊脂糖凝膠液。總液體量不宜超過錐瓶的 50%容量。否則會溢出來的。還要擦洗微波爐。加熱過程中要不時搖動,使附于瓶壁上的瓊脂糖顆粒進入溶液。加熱時應蓋上封口膜,以減少水份蒸發。


第二步:膠板的制備 

倒膠時的溫度不可太低,否則凝固不均勻。東一塊西一塊的。果凍做出來就不好看啦。速度也不可太快,否則容易出現氣泡。果凍做出來里面都是氣泡。怎么吃呀?待膠*凝固后撥出梳子,注意不要損傷梳底部的凝膠。


第三步:加樣 

注意上樣時要小心操作,避免損壞凝膠或將樣品槽底部凝膠刺穿。果凍下面被戳個窟窿,還怎么吃呀?


第四步:電泳 

加完樣后,合上電泳槽蓋,立即接通電源。控制電壓保持在 60-80V,電流在 40mA 以上。當溴酚藍條帶移動到距凝膠前沿約 2cm 時,停止電泳。

【DNA 電泳】教你做果凍:瓊脂糖凝膠電泳實驗技巧分享


第五步:染色 

未加 EB 的膠板在電泳完畢后移入 0.5μg/ml 的 EB 溶液中,室溫下染色 20-25 分鐘。


第六步:觀察和拍照 

在波長為 254nm 的長波長紫外燈下觀察染色后的或已加有 EB 的電泳膠板。DNA 存在處顯示 出肉眼可辨的桔紅色熒光條帶。紫光燈下觀察時應戴上防護眼鏡或有機玻璃面罩,以免損傷眼睛。


除這些細節之外,還有一些注意事項: 

1、酶切時所加的 DNA 溶液體積不能太大,否則 DNA 溶液中其他成分會干擾酶反應。 

2、酶活力通常用酶單位(U)表示,酶單位的定義是:在最適反應條件下,1 小時*降解 1 mg λDNA 的酶量為一個單位,但是許多實驗制備的 DNA 不象 λDNA 那樣易于降解,需適當增加酶的使用量。反應液中加入過量的酶是不合適的,除考慮成本外,酶液中的微量雜質 可能干擾隨后的反應。 

3、市場銷售的酶一般濃度很大,為了省著點兒花,使用時可事先用酶反應緩沖液進行稀釋。 另外,酶通常保存在 50%的甘油中,實驗中,應將反應液中甘油濃度控制在 10%以下,否則,酶活性將受影響。 

4、觀察 DNA 離不開紫外透射儀,可是紫外光對 DNA 分子有切割作用。從膠上回收 DNA 時, 應盡量縮短光照時間并采用長波長紫外燈(300-360nm),以減少紫外光切割 DNA。

5、EB 是強誘變劑,還有中等毒性,就是有致癌性。配制和使用時都要戴好手套。盡量不要把 EB 灑到桌面或地面上。如果真的不幸灑到桌面或地面上了,凡是沾污了 EB 的容器或物品必須經專門處理后才能清洗或丟棄。

6、當 EB 放太多了,膠染色過深,DNA 帶看不清的時候,可將膠放入蒸餾水沖泡,30 分鐘后再觀察。 


以上,安培君介紹了做果凍,啊,不!做瓊脂糖凝膠電泳實驗的一些小技巧小竅門,也希望大家伙兒做出好吃的“果凍"來。



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