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【教程】構建載體其實一點也不難!

時間:2021/8/26閱讀:2360
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我們在研究基因的功能時,逃脫不掉的就是為了我們的實驗目的,可能需要構建各種載體,比如表達載體,克隆載體,基因打靶載體等等。很多人在構建載體的時候都感覺很困難,特別是對于一個剛進入實驗室的新人來說那更是難上加難,*摸不著頭腦。

那是因為其實構建載體是一個不小的工作量,需要經歷很多的過程,比如首先我們需要設計引物引入酶切位點,接下來還需要經歷酶切酶連等過程,只要其中的某一環節出現問題,那最終都會導致實驗失敗。

構建載體最關鍵的一步就是設計引物引入酶切位點,一旦引物設計好,那接下來就非常簡單了,今天重點就來教教大家如何利用 snapgene 輕松獲得構建載體所需的引物序列。 

1. 打開軟件,選擇第一個(紅線標記),然后輸入基因的 CCDS 序列(基因的 CCDS 序列可在 NCBI 數據庫中獲得)


【教程】構建載體其實一點也不難!

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2. 點擊 ok 后界面如下,圖中顯示的是會切割基因編碼序列的酶


【教程】構建載體其實一點也不難!


3. 接下來點擊最上面的 Enzymes Noncutters,會顯示所有不會切割基因編碼序列的酶,這些酶都是我們可以用的,選酶的標準:要選擇不能切割目的基因序列并且質粒上含有的酶,還有就是最好是實驗室有的酶。

【教程】構建載體其實一點也不難!

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4. 確定了可以用的酶后,接下來需要確定設計引物時用的這兩種酶,確定方法:這兩種酶最好不要鄰近,最好使用雙酶切有共同 buffer 的酶,兩個酶切位點最好不要是同尾酶(切下來的殘基不要互補),否則效果相當于單酶切。 


5. 確定了所要用的酶之后,接下來需要做的就是設計引物并引入酶切位點(注意:一定要看清楚載體上 promoter 的方向,將 CDS 正向插入到 promoter 后面) 


6. 點擊左下角的 sequence,然后拉取上游一部分基因本身的序列,拉取的時候會顯示拉取的堿基的個數以及 Tm 值,拉取到 Tm 值 55 度左右就可以(55 度以上最好)

【教程】構建載體其實一點也不難!


7. 然后點擊 primer——add primer,選擇 top strand


【教程】構建載體其實一點也不難!

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8. 點擊 insertions,在 site 位置處選擇你準備引入的酶,比如我要引入 EcoR I,那我就選擇它,然后點擊 insert,這樣我們就引入了該酶的酶切位點。


【教程】構建載體其實一點也不難!

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9. 接下來需要添加保護堿基,一般所有的酶的保護堿基都加三個,加哪個堿基沒有要求,使 GC 含量及 Tm 值適中即可。


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10. 這樣上游引物就設計好了,接下來需要檢測一下引物是否會形成發卡結構,可以應用 OligoCalc,如果發現會形成發卡結構,那就需要對引物序列做出一些調整,直到發卡結構消失。 


11. 接下來拉取基因的下游的一部分序列,用同樣的方法設計好下游引物,有一點需要注意的是,設計下游引物的時候選擇 bottom strand。 


這樣構建載體所需的引物就設計好了,怎么樣,是不是感覺其實也沒有那么難,接下來就可以構建屬于你自己的載體了。

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