一、制片

選無自發性熒光的石英玻片或普通優質玻片，洗凈后浸泡于無水/醇和乙氧,基乙,烷等量混合液中。用時取出用綢布擦凈。將待檢樣品如組織塊剪成適當大小印壓于玻片上。也可采用冰凍切片或石蠟切片樣品。

二、固定

除研究細胞表面抗原或不穩定抗原可不固定外，一般均應固定。

三、水洗

固定后以冷的0.01 Mol/L pH7.4PBS液浸泡沖洗，最后以蒸餾水沖洗，防止自發性熒光。

四、染色

染色分直接染色法與間接染色法。

1. 材料與試劑

(1)熒光抗體，稀釋至應用濃度。

(2)0.01 Mol/LpH7.4PBS液

(3)9份優質甘油加1份pH7.4PBS液即為甘油緩沖液。甘油有減少非特異性熒光的作用。

(4)帶蓋方盤

2. 直接染色法

(1)將固定好的玻片置于濕盤中，滴加熒光抗體染色液，以覆蓋為度，加蓋，37℃感做30

min~45min。

(2)PBS沖洗3次，每次沖洗3 min，即3x3沖洗。

(3)蒸餾水沖洗。

(4)滴甘油緩沖液一滴，封片，熒光顯微鏡檢查。

3. 間接染色法

(1)檢查抗原:

①取固定標本，加已知的免疫血清，37℃孵育30 min。

②以PBS液3x3沖洗。

③再加熒光標記的抗抗體，37℃℃孵育30 min。

④PBS 3x3沖洗。

⑤H2O沖洗，涼干。

6加甘油緩沖液，封片、鏡檢。

(2)檢查抗體:

①免疫后動物的淋巴組織涂片，自然干燥，甲醇固定，

2)滴加相應抗原液(按1:100~1:500稀釋)，37℃孵育30 min。

③PBS液3x3沖洗。

④加熒光抗體，37℃孵育30 min。

⑤PBS液3x3沖洗。

⑥水洗，涼干。

⑦加甘油緩沖液，封片、鏡檢。