脊髓神經元原代培養(yǎng)細胞實驗

　　一、背景

　　神經元原代培養(yǎng)是將胚胎哺乳動物中樞神經系統(tǒng)的部分組織，如大腦皮層、海馬、脊髓等腦組織直接取出，再接種培養(yǎng)的方法。目前國內、外有關神經元培養(yǎng)的方法較多，但在原代培養(yǎng)中神經元的純度和產量方面還存在一些急待解決的問題。由于神經元是一種高度分化的細胞，相對于其它細胞而言，神經元在體外更難以存活和生長。因此，體外培養(yǎng)神經元要求的培養(yǎng)方法和營養(yǎng)條件均較為特殊。

　　神經細胞的體外培養(yǎng)技術是研究神經源性疾病的發(fā)病機制、進程的一個重要工具，能很好的、直觀的反映離體神經元的發(fā)育狀況和生理活性，如何建立一個穩(wěn)定成熟的神經細胞培養(yǎng)體系是神經系統(tǒng)疾病體外實驗研究順利進行的基礎。隨著基礎醫(yī)學及臨床醫(yī)學研究的逐漸深入，神經細胞的體外培養(yǎng)技術在腦損傷、神經障礙性疾病、衰老相關神經疾病方面得到廣泛重視和普及應用。

　　二、脊髓神經元原代培養(yǎng)細胞實驗實驗步驟

　　(1)75%(體積分數(shù))酒精消毒孕鼠,在無菌條件下取出胎鼠,分離并切取脊髓,置于冷的無鈣、鎂的HBSS液的平皿中(下置冰袋)。

　　(2)解剖顯微鏡無菌條件下仔細剝離脊膜及血管。

　　(3)用彈簧剪將脊髓剪成1cm3大小，消化液37℃消化15-20min，每五分鐘振蕩一次；

　　(4)去掉上清，加入終止液終止消化，吹打10-15次，不能有氣泡，收集上清，剩余組織再消化一次。

　　(5)4℃1000rpm離心10min，棄上清，加入種植液1重懸，培養(yǎng)箱內差速貼壁30min；

　　(6)收集上清，臺盼藍染色計數(shù)，按6*105cells/孔種入六孔板（種植液1），37℃，5%CO2，95%飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；

　　(7)培養(yǎng)第二天，全換液更換為種植液2；

　　(8)培養(yǎng)第四天，半量換液加入5uM的阿糖胞苷，24h全量換液；

　　(9)之后每周換液兩次。