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主要內(nèi)容

1利用布魯克的單細(xì)胞光導(dǎo)系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)上千個(gè)MSC單細(xì)胞的分離、培養(yǎng)、表型特征鑒定和回收。

2通過單細(xì)胞光導(dǎo)系統(tǒng)獲得克隆的關(guān)鍵質(zhì)量屬性（CQA），包括生長(zhǎng)、克隆形成潛能以及多系分化潛力。

研究背景

間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）自從50多年前被分離和鑒定，已顯示出巨大的臨床潛力。MSCs具有可以分化成多種細(xì)胞類型的能力，包括成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和軟骨細(xì)胞。此外，它們免疫調(diào)節(jié)和抗炎特性使其適用于免疫治療和再生醫(yī)學(xué)，并成為組織工程領(lǐng)域的一個(gè)重要組成部分。

然而，觀察到的供體間、組織來源間以及細(xì)胞群體內(nèi)的異質(zhì)性對(duì)MSC作為再生療法的使用提出了挑戰(zhàn)，并可能影響其治療效果。當(dāng)細(xì)胞暴露于相同的刺激或環(huán)境條件下時(shí)，隨機(jī)過程可能導(dǎo)致截然不同的反應(yīng)。因此，傳統(tǒng)的測(cè)量MSC屬性的bulk方法可能會(huì)掩蓋細(xì)胞間的異質(zhì)性。還需要確定是否可能純化出更均一、更有療效活性的細(xì)胞群體。

通過與新加坡A*STAR的IMCB團(tuán)隊(duì)合作，我們利用布魯克細(xì)胞分析的單細(xì)胞光導(dǎo)系統(tǒng)，高精度操縱和分離單個(gè)細(xì)胞，并為單細(xì)胞生長(zhǎng)提供適當(dāng)?shù)沫h(huán)境，來應(yīng)對(duì)體外MSC擴(kuò)增和當(dāng)前單細(xì)胞表型分析的局限性所帶來的挑戰(zhàn)。這項(xiàng)技術(shù)無縫集成了光電定位和微流控技術(shù)、先進(jìn)的自動(dòng)化、培養(yǎng)、高分辨率成像能力和機(jī)器視覺算法，為研究人員提供全新的研究單細(xì)胞的方式。

單細(xì)胞光導(dǎo)系統(tǒng)MSC工作流程

使用OptoSelect® 1500芯片在Lightning™單細(xì)胞光導(dǎo)系統(tǒng)上對(duì)永生化MSC細(xì)胞系UE7T-13細(xì)胞進(jìn)行克隆，在芯片上培養(yǎng)六天，然后針對(duì)CD73、CD90和CD105表面標(biāo)志物進(jìn)行染色。在芯片上進(jìn)行表型和生長(zhǎng)特征鑒定后，將單個(gè)克隆從芯片中導(dǎo)出到96孔板中（圖1）。所有克隆在回收后都被繼續(xù)培養(yǎng)，一部分通過其他測(cè)定法和基本關(guān)鍵質(zhì)量屬性（CQAs）進(jìn)行評(píng)估，這些屬性由國(guó)際細(xì)胞治療學(xué)會(huì)（ISCT）確定用于定義MSCs [3]（具體實(shí)驗(yàn)方法參考完整應(yīng)用手冊(cè)）。

圖1. MSCs篩選工作流程示意圖。示意圖展示利用Beacon®進(jìn)行MSCs的克隆、培養(yǎng)、分析和導(dǎo)出后進(jìn)行下游分析的流程。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

UE7T-13s是一種源自人骨髓的永生化MSC細(xì)胞系，被克隆并培養(yǎng)在三張OptoSelect® 1500芯片上。芯片用Adherent Cell Reagents Kit潤(rùn)洗，經(jīng)過胰蛋白酶處理后的MSCs以2.5百萬細(xì)胞/毫升的密度被導(dǎo)入芯片上。一旦進(jìn)入芯片的通道，利用光電定位技術(shù)（OEP）以高精度將單個(gè)細(xì)胞移動(dòng)到NanoPen小室中。平均每張芯片有1,079 ± 219個(gè)單個(gè)MSCs被成功分離并持續(xù)培養(yǎng)六天（圖2）。

圖2. 使用OptoSelect® 1500芯片分離和篩選838-1264個(gè)MSCs單細(xì)胞。

僅幾個(gè)小時(shí)的培養(yǎng)后，就可以觀察到MSCs已經(jīng)粘附到芯片表面，并呈現(xiàn)出MSCs在2D組織培養(yǎng)處理表面上培養(yǎng)時(shí)的特征性擴(kuò)展形態(tài)。經(jīng)過六天的培養(yǎng)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行胰蛋白酶處理，并使用基于神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型的定制細(xì)胞檢測(cè)算法進(jìn)行計(jì)數(shù)。平均芯片上克隆擴(kuò)增的比例達(dá)到73.01 ± 6.88%（芯片上克隆擴(kuò)增定義為用單個(gè)細(xì)胞加載的NanoPens中，繼續(xù)擴(kuò)增成由四個(gè)或更多細(xì)胞組成的克隆的百分比）（圖3）。

圖3 細(xì)胞擴(kuò)增和倍增時(shí)間。芯片上培養(yǎng)的6天內(nèi)，67-81%的單細(xì)胞形成了四個(gè)細(xì)胞以上的克隆群體。

在分離和擴(kuò)增克隆MSCs期間，至關(guān)重要的是它們保留自我更新和分化的能力。為了確認(rèn)在布魯克單細(xì)胞光導(dǎo)系統(tǒng)上分離和培養(yǎng)的細(xì)胞保留了MSC表型，對(duì)六天后培養(yǎng)的克隆進(jìn)行了CD73、CD90或CD105的染色。這三種表面標(biāo)記已被ISCT認(rèn)為是鑒定人類MSCs的基本標(biāo)準(zhǔn)[3]。大約96.3%的克隆為CD73陽性，96.6%為CD105陽性，95.2%為CD73陽性（圖4）。

圖4. 關(guān)鍵MSC表面標(biāo)志物CD73、CD90和CD105在超過95%的單克隆中表達(dá)。

布魯克的單細(xì)胞光導(dǎo)系統(tǒng)能力之一是能夠在OptoSelect®芯片上培養(yǎng)和測(cè)定后回收單個(gè)克隆，可以根據(jù)克隆的擴(kuò)增或者表面標(biāo)志物回收特定克隆到96孔板的孔中。通過特殊的Bubble Dislodge方法，平均每個(gè)NanoPen中移出了7.4 ± 1.1個(gè)細(xì)胞，這約占每個(gè)小室中回收的總細(xì)胞數(shù)的59.3 ± 1.5%（圖5）。導(dǎo)出后，MSC克隆在37°C和5% CO2條件下培養(yǎng)，在含有100微升細(xì)胞培養(yǎng)基的96孔板中培養(yǎng)大約14天，然后對(duì)每個(gè)孔進(jìn)行成像以確定持續(xù)的擴(kuò)增。研究發(fā)現(xiàn)，從單個(gè)小室回收到8個(gè)或更多細(xì)胞的孔擴(kuò)增略好，有66.7%的孔在培養(yǎng)2周后達(dá)到至少25%的匯合度，而接收到2到7個(gè)細(xì)胞的孔這一比例為56%（圖5）。

圖5. a) 在MSC克隆導(dǎo)出不同階段的NanoPen圖像；b) 平均7.4 ± 1.1個(gè)細(xì)胞可成功從每個(gè)小室內(nèi)導(dǎo)出到96孔板上；c) 平均56.3 ± 1.5% 在小室內(nèi)擴(kuò)增的克隆被成功導(dǎo)出；d) 導(dǎo)出細(xì)胞數(shù)量對(duì)導(dǎo)出后克隆擴(kuò)增能力的影響。

限制間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）在臨床應(yīng)用中使用的一個(gè)主要挑戰(zhàn)是它們?cè)隗w外長(zhǎng)期擴(kuò)增過程中的衰老，這可能導(dǎo)致在次級(jí)培養(yǎng)過程中分化潛力的喪失[4]。為評(píng)估MSC克隆在經(jīng)過處理并從布魯克的單細(xì)胞光導(dǎo)系統(tǒng)導(dǎo)出后的克隆形成潛力和生長(zhǎng)特性，進(jìn)行了隨時(shí)間的生長(zhǎng)特性分析以及克隆形成測(cè)定（CFU-F），并將結(jié)果與由異質(zhì)MSCs群體組成的對(duì)照親本細(xì)胞系進(jìn)行比較。生長(zhǎng)特性分析顯示，三個(gè)擴(kuò)增克隆和對(duì)照親本細(xì)胞系之間的累積細(xì)胞數(shù)量相似。每個(gè)克隆的平均CFU-F效率在35%到62%之間，而對(duì)照親本細(xì)胞系的平均效率約為45%，這表明在OptoSelect®芯片上經(jīng)歷分離、培養(yǎng)和導(dǎo)出的MSC克隆保留了克隆形成能力（圖6）。

圖6. 克隆形成能力分析。在OptoSelect®芯片上導(dǎo)出并擴(kuò)增后的三個(gè)克隆以及對(duì)照親本細(xì)胞系的a) 累積細(xì)胞數(shù)量和b)平均CFU-F效率；c) 代表性圖像顯示了對(duì)照親本細(xì)胞系和三個(gè)克隆的集落形成情況。

為了確保MSC表型得以保留，對(duì)三個(gè)擴(kuò)增克隆進(jìn)行了CD73、CD90和CD105表面標(biāo)志物的染色。通過流式細(xì)胞分析，每個(gè)克隆中超過99%的細(xì)胞繼續(xù)表達(dá)所有三個(gè)標(biāo)記物，與親本細(xì)胞系相似（表1）。

表1. ISCT表面標(biāo)志物檢測(cè)結(jié)果

為了進(jìn)一步評(píng)估MSC的效力，三個(gè)克隆被置于特定的間充質(zhì)譜系誘導(dǎo)條件下，進(jìn)行28天的成骨分化和成脂分化。通過分化為成骨細(xì)胞（成骨譜系）的細(xì)胞外鈣沉積的茜素紅S染色強(qiáng)度，以及分化為脂肪細(xì)胞（脂肪譜系）的脂滴的油紅O染色強(qiáng)度來驗(yàn)證每個(gè)克隆的MSCs（n=3）分化為兩種譜系的能力（圖8）。這些結(jié)果表明，在布魯克單細(xì)胞光導(dǎo)系統(tǒng)上分離、培養(yǎng)和檢測(cè)的單個(gè)MSC克隆保留了強(qiáng)大的多譜系分化能力。

圖7. 多向分化能力。MSC克隆從單細(xì)胞光導(dǎo)系統(tǒng)導(dǎo)出后，分別進(jìn)入成骨（茜素紅S）或成脂分化（油紅O）。圖像顯示了含有未誘導(dǎo)或誘導(dǎo)分化的細(xì)胞的孔板。

結(jié)論

在這篇應(yīng)用說明中，我們展示了布魯克單細(xì)胞光導(dǎo)系統(tǒng)用于MSC的單細(xì)胞分離、培養(yǎng)、分析和導(dǎo)出，并獲取能夠幫助我們更好理解MSC異質(zhì)性及其對(duì)基于MSC的治療產(chǎn)品的影響的關(guān)鍵表型和功能數(shù)據(jù)。從單細(xì)胞光導(dǎo)系統(tǒng)中導(dǎo)出的MSC克隆保留了MSC表型、克隆形成潛能和分化潛力。

參考文獻(xiàn)

1. A. J. Friedenstein, R. K. Chailakhjan, and K. S. Lalykina, Cell and Tissue Kinetics, vol. 3, no. 4, pp. 393–403, 1970.

2. Costa, Luis A., et al. Cellular and Molecular Life Sciences 78 (2021): 447-467.

3. Dominici, M. L. B. K., et al. Cytotherapy 8.4 (2006): 315-317.

4. Li, Yi, et al. International journal of molecular medicine 39.4 (2017): 775-782.