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藥物研發過程中常涉及到復雜樣本的高通量檢測，如在藥物早期研發階段使用全長蛋白/多元復合物、臨床前用血清/血漿樣本進行PK檢測、ADA檢測等，在進行復雜樣本尤其是血清/血漿樣本的高通量檢測時，瑞孚迪AlphaLISA可為您提供簡單便捷且準確的高通量檢測方法！
瑞孚迪均相免洗技術包含HTRF和Alpha，Alpha除了具備均相免洗技術無需洗滌、信號穩定、靈敏度高、易于自動化等優勢外，還適用于復雜樣本的高通量檢測。下面小編就帶你走進瑞孚迪Alpha技術，展示它的魅力！
01
什么是Alpha技術？
Alpha (即Amplified Luminescent Proximity Homogeneous Assay) 是一種基于微珠的高靈敏度均相檢測技術，該技術使用供體和受體兩種微珠，當結合于供體微珠上的分子1與結合于受體微珠上的分子2發生相互作用，距離<200 nm時，即可檢測出發光信號，該技術突破了其他反應體系的局限性，不但可以檢測常規的小分子相互作用，如抗原抗體、第二信使、配體、細胞因子與受體間相互作用，還可以用于檢測完整蛋白質、酶復合體、噬菌體等相對分子質量巨大或非常復雜的復合物和相互作用。
02
Alpha技術檢測原理
Alpha技術供體微珠表面含有化學物質光敏劑，在680 nm的光激發下，將周圍的氧氣分子 (O2) 變成單線態氧 (1O2)，單線態氧在溶液中擴散將能量傳遞給200 nm范圍以內的受體微珠，引發一系列級聯放大的化學反應，從而產生特定波長的光。以AlphaLISA細胞因子檢測試劑盒為例，當待檢樣本中含有相應細胞因子時，供體微珠和受體微珠可特異性與該細胞因子結合，從而拉進供受體微珠的距離，引發受體珠中的級聯能量轉移，導致在615 nm處出現尖銳的發光峰值，AlphaLISA檢測信號則與樣本中存在的細胞因子的量成正比，原理圖如圖1所示。
圖1. Alpha技術檢測原理
03
Alpha技術分類
在Alpha技術中，供體微珠是相同的，受體微珠根據表面化學染料的不同，可分為四種類型：
1.AlphaScreen——第一代Alpha技術
受體微珠化學染料：紅熒烯；發射波長：520-620 nm
2.AlphaLISA——升級后的Alpha技術
受體微珠化學染料：銪Eu；發射波長：615-623 nm
相比于AlphaScreen的寬波譜，AlphaLISA受體微珠所在的波長區域 (615-623 nm) 可有效避免血清和血漿樣品的熒光背景干擾 (波長區域300-600 nm) 以及氧合血紅蛋白的吸收干擾 (波長區域<600 nm)，適用于各種臨床前和臨床中血清和血漿樣本的高通量檢測。
3.AlphaPlex 545——Alpha技術的多重檢測
受體微珠化學染料：鋱Tb；發射波長：515-555 nm
供體微球與AlphaLISA、AlphaPlex 545 和AlphaPlex 645 受體微球相互作用，可以在一個微孔板孔內檢測2-3種指標。
4.AlphaPlex 645——Alpha技術的多重檢測
受體微珠化學染料：釤Sm；發射波長：645 nm
供體微球與AlphaLISA、AlphaPlex 545 和AlphaPlex 645 受體微球相互作用，可以在一個微孔板孔內檢測2-3種指標。
四種受體微珠的發射波譜示意圖如下：
圖2. 四種受體微珠的發射波譜
04
Alpha技術應用案例
案例一 血清樣本非洲豬瘟檢測方法建立
非洲豬瘟病毒(ASFV)基因組范圍在170~190 kb之間，共注釋了151個基因，衣殼蛋白p72是ASFV自然感染的主要免疫原，是ASFV免疫診斷試驗的候選分子。本實驗建立AlphaLISA具有高靈敏度、強特異性和強相關性，對快速準確檢測ASFV具有良好的應用前景[1]。
標準曲線的建立
分別兩倍連續稀釋ASFV p72 (100~1.5625 ng/ml) 和ASFV陽性血清 (1：2~1：256) ，如圖3顯示，AlphaLISA信號與ASFV p72及ASFV陽性血清稀釋度之間存在良好的線性或非線性關系。
圖3. p72的標準定量曲線 (A) 和ASFV陽性血清倍比稀釋曲線 (B)
Cut-off值、靈敏度和特異性
通過20份SPF豬血清確認AlphaLISA檢測方法的cut-off值為264.05，檢測下限（靈敏度）為0.78 ng/ml。并進行交叉反應實驗驗證 (CSFV、 PRV、PRRSV、PPV、PCV2和PEDV) 以證明AlphaLISA方法的特異性和準確性，結果如圖4所示。
圖4. p72 cut-off值和交叉反應實驗結果
方法評估
采用AlphaLISA、Real-Time PCR檢測和抗原檢測試劑盒分別檢測60份臨床血清樣本，Real-Time PCR檢測結果顯示，29份ASFV陽性，31份ASFV陰性；抗原檢測試劑盒結果顯示ASFV陽性24例，ASFV陰性36例，而AlphaLISA結果顯示ASFV陽性27例，ASFV陰性33例。與Real-Time PCR檢測相比，AlphaLISA的敏感性為93.1%，特異性為100%，相關系數為0.967，與抗原檢測試劑盒相比，AlphaLISA的敏感性、特異性和相關系數分別為100%、91.7%和0.95。
案例二 PBMC上清細胞因子檢測
PBMC通常用作體外模型篩選和鑒定針對靶向免疫途徑的藥物，因此，測量PBMC細胞模型的細胞因子分泌的能力往往需要靈敏、穩定的檢測方法。本案例使用高靈敏度和穩定性的AlphaLISA 高性能細胞因子檢測試劑盒，是細胞因子研究，實現以小樣本量準確檢測簡單到復雜基質中的內源細胞因子。
本實驗涉及到AlphaLISA高性能版細胞因子檢測試劑盒Human IFN-γ (#AL3153), Human IL-2 (#AL3155), Human TNF-α (#AL3157), Human IL-10 (#AL3159), Human IL-1β (#AL3160), Human IL-17A (#AL3161), Human CXCL10(#AL3163), and Human IL-8 (#AL3164)等細胞因子檢測試劑盒。
實驗結果
收集了所有測試細胞因子的數據后，計算LDL和LLOQ值。如圖5所示，所有的試劑盒的LLOQ都達到pg/mL級別的高靈敏度。
圖5. 檢測下限和定量下限列表
在圖6中可見，以IL-2為例，PBMC上清待測樣本可進行大倍數稀釋或不稀釋，都能獲得較大的實驗窗口。因此，當需要在一個樣本中檢測多個細胞因子時，則可以選擇相同的稀釋倍數來稀釋樣本后再分別進行檢測，可減少多種稀釋倍數帶來的實驗干擾與誤差，從而更快速準確地獲得多個細胞因子的檢測數據。同時又因為AlphaLISA檢測只需要5-10 ul的樣本量，一個96樣本孔的上清足夠同時支持多個細胞因子的檢測，大大節省PBMC的使用成本。同時，均相免洗的實驗操作以及小體積的檢測更兼容自動化儀器，實現真正的高通量樣本檢測。
圖6. 檢測梯度稀釋PBMC上清中的IL-2
案例三 PROTAC三元復合物結合實驗
AlphaLISA tool box試劑可以成功地用于檢測靶向蛋白降解應用的三元復合物形成，篩選用于藥物發現的PROTAC分子。當靶蛋白和E3連接酶通過PROTAC成功地以三元復合物的形式連接時，抗標簽供體和受體微珠將靠近并產生Alpha信號。
圖7. AlphaLISA三元復合物結合實驗模型
案例以BRD4和CRBN三元復合物結合實驗為例，介紹AlphaLISA在三元復合物檢測中的應用。該實驗的BRD4蛋白為重組GST-BRD4，CRBN復合物為重組人Cereblon/DDB1/Cul4A/Rbx1復合物，在Cereblon和DDB1亞基上帶有N端flag標簽，在Cul4A和Rbx1亞基上帶有N端6x His標簽，作為E3連接酶。
如圖8所示，PROTAC dBET6的滴定顯示出鐘形曲線，在~100 nM處觀察到鉤點。PROTAC dBET1也產生了鐘形曲線，表明與該PROTAC成功形成三元復合物，然而，鉤點略有增加(~250 nM)，表明dBET1形成三元復合物的效率低于dBET6。先前的研究提出dBET6比dBET1更有效的降解物，dBET6處理的細胞中蛋白降解更加明顯。相反，不相關的PROTAC：MT-802及對照分子則沒有AlphaLISA信號。
圖8. 三元復合物中PROTACs的滴定
05
儀器推薦
VICTOR®Nivo™Alpha
VICTOR®Nivo™Alpha是一款性價比高，檢測效果佳的Alpha儀器。對于從事Alpha檢測的實驗室，這款儀器將是您
最新的VICTOR®Nivo™多模式微孔板讀板儀配置了高靈敏Alpha技術的所有硬件：680 nm激光光源用來激發供體微珠，D660專業二向色鏡和Alpha 專用發射濾光片。同時，VICTOR® Nivo™通過特殊的設計，阻攔激發時發射信號的檢測，從而降低了背景信號。
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微孔板推薦
瑞孚迪AlphaPlate淺灰色微孔板，專為瑞孚迪AlphaLISA和AlphaScreen檢測技術而設計，是目前采用淺灰色設計的微孔板，可顯著降低信號交叉干擾多達17倍，優化檢測信號信噪比值并提高整體Z'值。
如果您對Alpha技術感興趣，或需要更詳細的產品資料，可以聯系上海瑋馳。
參考文獻
[1] Dongjie Chen, Di Wang, Caixia Wang, F. Wei, Hongyuan Zhao, Xiangmei Lin, Shaoqiang Wu less. Application of an AlphaLISA method for rapid sensitive detection of African swine fever virus in porcine serum. Applied Microbiology and Biotechnology. 29 May 2021. DOI:10.1007/s00253-021-11339-2
