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Cytodex1和WAVE 25在高效無血清培養間充質干細胞的應用
干細胞 作為一種能夠自我更新和分化的細胞類型，已經為世人熟知。自被發現起，干細胞就一直是研究熱點。根據《 2016-2022 年中國干細胞醫療行業市場現狀與行業前景調研分析報告》，2010 年干細胞產業市場規模為 215 億美元，到 2015 年時已增至 635 億美元。預測到 2020 年，干細胞市場規模達到 4000 億美元。
作為在再生醫學中使用的干細胞類型，間充質干細胞（MSC）有著巨大的市場價值空間且不斷被看好。
如今，MSC 是臨床試驗中干細胞類型，也是科學文獻中研究多的干細胞類型。
范圍內其相關的臨床試驗超過 900 項，中國臨床試驗注冊中心注冊的 MSC 臨床試驗超過 104 項。這充分說明 MSC 治療是世界范圍內臨床應用研究的熱點，而我國在這一領域的發展也勢頭強勁。
MSC 幾乎存在于我們體內的所有組織中，但常見于骨髓、脂肪組織、臍帶組織、臍帶血和胎盤。除了具有多功能性和分化成多種細胞譜系外，它們還能分泌多種細胞因子和生長因子，從而實現免疫調節，促進損傷愈合和組織再生。
MSC 非常適合細胞治療的臨床應用，因為它們具有多種譜系分化潛力。
它們可以在體外或體內分化成不同類型的功能細胞以代替老化或受損細胞。因為 MSC 的這些特性，其在 2020 年的治療中也表現出了積極效果，病毒感染誘發機體內嚴重的炎癥反應，炎性細胞因子增加、外周淋巴細胞減少、肺部損傷等，MSC 具有免疫調節能力和損傷修復功能，所以具有治療的潛能。目前的初步臨床結果顯示間充質干細胞移植具有安全性和初步的有效性，能夠為重癥患者提供新的治療工具。
當前，干細胞療法處在技術到產品轉化的過度階段。那么如何在體外進行細胞規模化的高效擴增，是 MSC 應用中的關鍵。
傳統擴增 MSC 的主要方式是采用方瓶、細胞工廠等進行 2D 貼壁培養，一個病人單次需要回輸幾個億單位的細胞，那么就需要大量的 2D 培養容器以及操作人員；對于貼壁類型的細胞培養，如果想要規模化生產，微載體是不錯的選擇方式，新型的擴增 MSC 的方式是使用微載體以及波浪式反應器 WAVE，可以高效的進行干細胞的擴增，培養過程如下：
一、實驗材料
細胞：間充質干細胞
培養方式：微載體 Cytodex 1 貼壁培養
培養基：無血清無外源蛋白成份明確間充質干細胞培養基（由原能細胞科技集團自主開發）
反應器：WAVE 25
二、實驗步驟
1.
微載體的預處理
1.1 微載體處理：Cytodex 1 使用 DPBS 泡發 3 h。
1.2 使用 DPBS 洗滌 2 次 Cytodex 1，DPBS 浸泡后滅菌（121℃，30 min）。
1.3 Cytodex 1 冷卻沉淀后，棄上清，安全柜內無血清培養基洗滌 2 次，定容。
2.
WAVE 的操作
2.1 無菌環境下拆開細胞袋，安裝無菌空氣濾器等配件。
2.2 將微載體培養液及細胞懸浮液依次從細胞袋輸液管道輸入。
2.3 將細胞袋固定在 WAVE 反應器托盤上，連接空氣泵，設定溫度 37 ± 0.5 度、泵壓、反應器轉速度和角度。
3.
MSC 細胞接種及培養過程
3.1 按 6000 cells/cm2接種新鮮 MSC 細胞至微載體培養液中（3 g/L）），孵育 30 min-1 h（間歇式搖勻）或者孵育過夜，調節轉速至細胞不沉降聚集即可。
3.2 每隔一天從細胞袋無菌取樣口用無菌注射器抽取 5 ml-10 ml 培養液進行鏡檢及支原體、內毒素等安全性質量檢測。
3.3 培養 4-5 天，細胞長滿。
4.
MSC細胞的收獲
4.1 培養 4-5 天后將細胞微載體懸浮液從細胞袋出液管道輸出至細胞收集瓶。
4.2 棄上清，DPBS 洗滌一遍，加入 Tryple 消化酶，溫和搖勻消化 10 min-15 min。靜置，待微載體沉降后，吸取細胞懸浮液。DPBS 再洗滌 2 遍，吸取細胞懸浮液。
4.3 離心 400×g，5 min。收集細胞，計數。
三、實驗結果
1.
細胞生長情況
按0.6 × 104 cells/cm2接種新鮮MSC細胞至微載體培養液中（3g/L），4-5天后細胞可以長滿Cytodex 1，每cm2可以生長2.5 × 104 MSC，細胞在Cytodex 1上的生長照片如下圖1。
圖 1. 微載體培養 MSC 生長圖片
2.
流式細胞儀檢測MSC細胞表面標記物
藥典對 MSC 細胞表面標記物的檢測要求是：CD73、CD90、CD105 ≥ 95%；CD11b、CD19、CD34、CD45、HLA-DR ≤ 2%。對上述培養的細胞進行檢測，結果顯示細胞表面標記物均滿足要求并且陽性指標 CD73、CD90、CD105 、CD44 ≥ 98%，陰性指標 CD11b、CD19、CD34、CD45、HLA-DR 總和≤ 2%（數據未顯示）。
圖2. 微載體培養MSC流式表型
3.
MSC 成脂和成骨分化
對 MSC 進行成脂和成骨誘導分化，油紅 O 染色后顯示成脂效果很好；茜素紅 S 染色顯示成骨效果很好。
圖3. 微載體培養MSC成脂分化
圖4. 微載體培養MSC成骨分化
四、成本分析
以培養單人次回輸細胞量 3.2×109 cells 為例，對比新型和傳統擴增 MSC 方式的成本分析，主要從培養階段的耗材成本和人員成本角度考慮，其中耗材成本如下圖 5，使用 Cytodex 1 和 WAVE 的培養方式相較于 150 mm Dish 能夠節約 14%，相較于 Hyper Flask 能夠節約 190% 的耗材成本。人員成本角度列于表 1，使用 Cytodex 1 和 WAVE 的培養方式可以減少培養批次，從而降低批次間變異性，同時擁有合理的人員成本。
圖5.不同培養方式耗材成本分析
表1.不同培養方式人員成本分析及批次數