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如何構建多順反子表達載體？
隨著各種基因組測序項目的完成，越來越多的基因被發現，但多數基因功能不明，故研究基因的功能十分重要。分子克隆是基因功能研究中zui為基礎和關鍵的內容。利用分子克隆技術將外源基因插入質粒載體，進行外源基因的表達可能不是一件難事。但要同時表達多個基因時，傳統的方法可能就比較困難。下面給大家介紹一種多個外源基因表達的方法—構建多順反子表達載體。
以EGFRvIII基因、P2A多順反子元件、iRFP720基因插入到pLVX-TetOne載體中為例，介紹如何利用傳統酶切酶連技術和同源重組技術進行構建多順反子表達載體。 
酶切酶連技術
使用傳統酶切酶連法進行克隆時，首先需要分析酶切位點，經分析發現只有AgeI和BstZ17I兩個酶切位點可用于EGFRvIII基因克隆，因為另外兩個酶切位點BamHI和EcoRI同時存在于EGFRvIII基因的內部，導致無法使用。而P2A元件和iRFP720基因必須和EGFRvIII基因處于同一個讀碼框，又導致無法使用AgeI酶切位點進行后續的克隆。針對這種酶切位點無法選擇的情況，我們可以選擇不需要考慮酶切位點的同源重組技術。
同源重組技術
使用同源重組技術無需考慮載體的酶切位點，只需在目的片段特異性上、下游引物5’端引入與線性化載體末端同源序列（15-25bp）即可。
1、制備線性化載體：可以用PCR或酶切的方式得到線性化的pLVX-TetOne載體。（膠回收純化）
2、目的基因的引物設計：EGFRvIII上游引物、 RFP720下游引物分別與線性化的pLVX-TetOne載體具有15-25bp的同源序列，并且EGFRvIII，P2A及iRFP720片段彼此之間也有15-25bp的同源序列。（這里要提到的是，P2A元件很短，僅有66 bp，有可能被重組酶中的外切酶*降解。我們可以通過兩輪PCR，在擴增iRFP720基因的上游引物的5’端引入部分P2A序列，即可獲得P2A + iRFP重組片段。對于這種目的基因過短的情況，可以采取這種方式。）
3、目的基因的擴增：EGFRvIII，P2A及iRFP720三個基因的擴增。（膠回收純化）
4、重組反應：將EGFRvIII，P2A及iRFP720三個基因同時插入到pLVX-TetOne載體中。
5、轉化：將重組反應物轉化到克隆感受態細胞中。
6、克隆鑒定：通過菌落PCR，雙酶切或測序鑒定陽性克隆。
7、表達：轉到表達感受態中進行表達。實現Tet-on誘導表達EGFRvIII基因，同時還能表達iRFP720基因，用于小動物活體熒光成像。
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