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進行基因功能研究時，如能包含信號通路無疑會提升故事的深度和完整性。研究信號通路很重要的一個手段是過表達基因，觀察表型變化。今天就向大家介紹一個過表達基因的技術——過表達載體的構建。下面就從目的基因調取、引物設計、過表達質粒構建詳細說明。
以人pyrin基因、pWPI-eGFP過表達質粒為例，構建慢病毒過表達載體pWPI-eGFP-pyrin。
一、pyrin基因序列的調取
進入NCBI數據庫（http://www.ncbi.nlm.nih.gov），
選擇pyrin種屬來源，如人
選擇基因亞型，需查閱文獻（根據實驗需求，并查閱文獻發現pyrin亞型1與研究目的一致）
點擊NM 000243.2，查找到基因pyrin的CDS區，
二、克隆方法的選擇
n 粘性末端克隆法
該方法需要在目的基因pyrin引物的5’端加上酶切位點，方法如下：
1. 酶切位點選擇
1）pWPI-eGFP質粒中帶有啟動子EF-1α（與CMV啟動子類似），雙酶切可選擇SwaⅠ與PmeⅠ或PacⅠ與PmeⅠ。注意不要選SwaⅠ與PacⅠ，因為雙酶切時兩個酶切位點的距離應相差在9bp以上。在這里，我們選用PacⅠ與PmeⅠ雙酶切距離說明。
2）雙酶切時，需要在酶切位點前面加上保護堿基，以保證*的酶切效率。選取酶切效率zui高的保護堿基。
2. pyrin基因的引物設計
以PacⅠ與PmeⅠ雙酶切為例，pyrin基因的上下游引物為
3. 設計好引物后，PCR擴增pyrin基因，跑膠回收PCR產物，PacⅠ與PmeⅠ雙酶切pWPI質粒和pyrin基因，回收酶切產物，連接轉化即可。
4. 挑取單克隆，驗證，獲得陽性克隆。
粘性末端克隆獲得的重組質粒可用于瞬轉，研究基因功能。但是，要長時間穩定過表達基因，就需要慢病毒包裝，此時pWPI-eGFP中的cPPT/CTS需要保留，那么PmeⅠ就不適合進行酶切載體。此時就需要另外一種克隆方法——一步法克隆。
n 一步法克隆法
該方法需要在pyrin基因引物的5’端添加與pWPI載體末端相同的重疊序列，具體做法如下：
1. 酶切位點的選擇
根據慢病毒包裝的要求，pyrin基因需要插入在cPPT/CTS位點前面，此時載體的線性化可以通過SwaⅠ或PacⅠ單酶切實現。
2. pyrin基因的引物設計
1）重疊序列大小為15-20bp，酶切位點不計算在內；2）以PacⅠ單酶切為例，pyrin基因的上下游引物為：
3. 設計好引物后，PCR擴增pyrin基因，膠回收產物與載體酶切回收產物發生重組反應。
4 挑取單克隆，驗證，獲得陽性克隆。
三、質粒構建成功后，轉染細胞，觀察是否表達。若進行穩轉，后續還需使用該重組質粒包裝慢病毒。
四、注意事項
1、可通過GFP蛋白的表達情況，觀察轉染效率。若轉染效率較低，可通過抗生素篩選，提高整合基因到基因組的細胞的純度。因pWPI-eGFP質粒不帶有哺乳動物細胞藥物篩選基因，因此可以通過流式細胞術篩選，獲得帶有GFP陽性的細胞，使整合基因到基因組的細胞純度提高。
2、還可以通過有限稀釋法獲得單個陽性克隆的細胞，避免在細胞傳代過程中，由于細胞不斷分裂，過表達的效果不斷減弱造成的表型不明顯現象的發生。
3、本案例較為特殊，對于其他過表達載體構建或慢病毒包裝而言，一步法克隆方法與粘性末端克隆方法或許均可使用。
HB170904
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