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背景介紹
熒光素酶生物檢測技術誕生于1990年，已有供了更可靠的研究30年的發展史。單熒光素酶檢測系統到雙熒光素酶檢測系統的發展，為科研人員提供了更為嚴謹的實驗手段。雙熒光素酶報告基因檢測系統在原有的基礎上引入了海腎報告基因，可以排除不同組之間細胞生長狀況、細胞數目以及轉染效率帶來的干擾，起到校正的作用，從而使實驗結果更為可靠。其發光原理如下圖1。
圖1 雙熒光素酶發光原理
實驗方案
將靶基因的轉錄調控元件或5’啟動子區克隆在Firefly luciferase基因的上游，或把3’-UTR區或lncRNA結合序列克隆在Firefly luciferase基因的下游，以研究啟動子的強弱和轉錄因子對啟動子的作用或miRNA對目的基因或lncRNA的調控作用。如圖2.
圖2 報告基因系統用于基因表達調控研究
實驗應用
1）啟動子、增強子、轉錄因子的研究；
2 ) 信號轉導通路的研究；
3）蛋白質相互作用；
4）miRNA、LncRNA、siRNA等的研究。
。。。
雙報告基因檢測試劑盒多用于動物細胞中，也有相關科研人員以植物為研究對象。不同的研究對象其操作流程有一定的差異。這里為大家提供細胞、煙草葉片和原生質體這三種研究對象對應的操作流程：
一、細胞篇
1、制備重組質粒
2、共轉染：將Luc/Ren載體和目的基因進行共轉染，通常24-48h(選擇轉染效率較高的細胞如293T)，載體的轉染比例要進行摸索（如1:10、1:20、1:50、1:100），原則上海腎熒光素酶讀值不蓋過主報告基因讀值為好。具體的轉染流程參照相關說明書；
3、細胞裂解處理
a: 對于貼壁細胞，吸盡細胞培養液，按照下表比例加入細胞裂解液，輕輕旋轉培養皿或者培養板使裂
解液*覆蓋細胞；
b: 對于懸浮細胞，離心棄去上清，按照下表比例加入裂解液；
細胞培養板 | 96孔板 | 48孔板 | 24孔板 | 12孔板 | 6孔板 |
裂解液加入量 | 100μL | 150μL | 200μL | 300μL | 500μL |
冰上孵育5min，充分裂解細胞。10000-16000rpm離心1min，取上清；
4、熒光檢測（使用含有生物發光或化學發光模塊的酶標儀）
取20 μL細胞裂解液，加至黑色酶標板中。加入100 μL 1×螢火蟲熒光素酶反應液，震板混勻，檢測螢火蟲熒光素酶的活力; 加入100 μL 1×海腎熒光素酶反應液，檢測海腎熒光素酶的活力。兩個反應都在30min完成。
5、數據分析：實驗結果為Luc值與Ren值之比。
二、煙草葉片篇
1、制備重組質粒
2、農桿菌轉化及培養：質粒轉化比例需要摸索。轉化后需過夜培養，OD600達到0.8以上即可；
3、利用無針頭注射器注射葉片，（先用針頭在葉片上扎個小孔）（注射煙草頂端以下第3-5片葉片）；
4、暗培養1d，光照培養2d;
5、取葉片進行打孔，8mm-1.5cm即可;
6、在2mL的EP管中加入預冷的小鋼珠，放入3-4片煙草葉盤并加入適量的液氮，使用儀器進行研磨破碎（45Hz，30s），加入100μL裂解液，10000-16000rpm離心2min，取上清20μL進行檢測。
7、檢測：方法同動物細胞。
三、原生質體篇
1、原生質體的制備：不同植物原生質體的分離略有差異，請參考相關文獻；
2、原生質體的計數與活力測定：取少量原生質體稀釋液滴加在0.1mm的血球計數板上，在光學顯微鏡下觀察計數。用0.01% FDA進行染色，在顯微鏡下對發綠色熒光的原生質體進行計數。計算原生質體的活力。
3、構建重組載體；
4、PEG-Ca2+介導原生質體的轉化：用MMG溶液重懸原生質體。在1.5mL EP管中加入Luc、Ren載體（比例需摸索）、100μL 原生質體和110μL PEG4000-Ca2+溶液，黑暗處放置20min，加入W5終止反應，離心棄上清，用1mL W1溶液重懸原生質體并轉移至細胞培養板中，25℃靜置培養20h；
5、原生質體的裂解：將原生質體加入2mL離心管中，離心收集原生質體，加入100μL左右的裂解液，冰上孵育10min左右。10000-16000rpm離心5min。
6、檢測：取20μL上清至1.5mL EP管中，檢測方法同動物細胞。
FAQ
Q1: 如何選擇海腎報告基因質粒？
A1: 盡量選擇中等強度的啟動子，如TK啟動子等，不要選擇強啟動子CMV、SV40等。海腎基因的表達活性應顯著高于背景組，同時不干擾螢火蟲熒光素酶報告基因的表達。
Q2: 如何選擇螢火蟲報告基因質粒？
A2：原則上含有luc基因就可以，但是不同實驗所需的載體有一定差異，如研究miRNA、轉錄因子的載體是不同的。小翊為大家提供了多種研究轉錄因子活性的報告基因載體，可以直接使用，如果您要自己構建載體，要注意有些載體沒有啟動子，需要自行插入啟動子，如pGL3 Basic。
Q3: psiCHECK-2的主報告基因是海腎報告基因，而不是螢火蟲報告基因，能用于雙熒光素酶報告基因檢測實驗嗎？
A2：該質粒可以用于雙熒光素酶報告基因檢測實驗，本試劑盒的檢測原理是酶和底物的反應，兩種酶經裂解處理后都會釋放出來，所以使用該質粒不影響檢測實驗。后的數值為Ren值與Luc值之比。
Q4: 檢測體系可以自行調整嗎？
A4: 我們推薦20μL裂解液，100μL螢火蟲熒光素酶底物，100μL海腎熒光素酶底物。底物的量可以適當調整，但是要保證底物是足量的。
Q5: 數值低，什么原因造成的？
A5: 可能是啟動子活性、轉染效率低、裂解不充分、底物失效、操作不規范等原因造成的，具體的原因需要實驗者進行排查。
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