慢病毒轉(zhuǎn)染實驗
- 公司名稱 上海達為科生物科技有限公司
- 品牌 其他品牌
- 型號
- 產(chǎn)地
- 廠商性質(zhì) 生產(chǎn)廠家
- 更新時間 2025/7/10 13:12:52
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一、技術(shù)定義與核心價值
慢病毒轉(zhuǎn)染是利用改造后的慢病毒載體將外源基因遞送至靶細胞，實現(xiàn)長期穩(wěn)定表達的基因?qū)爰夹g(shù)。其核心優(yōu)勢包括：
廣譜細胞適用性：可感染分裂細胞與非分裂細胞（如神經(jīng)元、干細胞、原代細胞），突破傳統(tǒng)轉(zhuǎn)染限制 。
高效整合表達：病毒RNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄為DNA后整合至宿主基因組，實現(xiàn)外源基因的yong久性表達 。
低免疫原性：刪除病毒致病基因（如HIV的 tat、rev），顯著降低宿主免疫反應(yīng) 。
操作便捷性：無需復(fù)雜轉(zhuǎn)染試劑，通過病毒顆粒直接感染細胞 。
術(shù)語辨析：
轉(zhuǎn)染（Transfection） ：通常指非病毒介導(dǎo)的核酸導(dǎo)入（如電穿孔、脂質(zhì)體）。
轉(zhuǎn)導(dǎo)（Transduction） ：特指病毒介導(dǎo)的基因傳遞，慢病毒技術(shù)屬于此類 。
二、分子機制：從病毒包裝到基因整合
（一）慢病毒載體系統(tǒng)構(gòu)成
| 組分 | 功能 | 技術(shù)演進 |
|---|---|---|
| 轉(zhuǎn)移質(zhì)粒 | 攜帶外源基因（如cDNA、shRNA）及包裝信號（Ψ） | 第三代載體刪除 tat，改用CMV啟動子驅(qū)動轉(zhuǎn)錄 |
| 包裝質(zhì)粒 | 表達病毒結(jié)構(gòu)蛋白（Gag、Pol） | 分割為gag/pol與rev兩質(zhì)粒，降低重組風險 |
| 包膜蛋白質(zhì)粒 | 表達VSV-G蛋白（水皰性口炎病毒G蛋白），決定宿主范圍 | 替代HIV天然包膜，擴大感染細胞類型 |
| 輔助質(zhì)粒 | 提供Rev蛋白，促進未剪接RNA出核 | 增強病毒產(chǎn)量 |
（二）宿主細胞內(nèi)的基因遞送流程
病毒進入：VSV-G蛋白結(jié)合靶細胞膜受體（如LDLR），介導(dǎo)膜融合 。
逆轉(zhuǎn)錄與入核：病毒RNA在胞質(zhì)逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，經(jīng)整合前復(fù)合體（PIC）轉(zhuǎn)運至核內(nèi) 。
基因組整合：病毒整合酶（Integrase）將cDNA隨機插入宿主染色體，實現(xiàn)yong久性表達 。
三、標準操作流程與技術(shù)優(yōu)化
（一）病毒包裝與純化（以293T細胞為例）
| 步驟 | 操作要點 | 質(zhì)控標準 |
|---|---|---|
| 質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染 | 四質(zhì)粒系統(tǒng)（轉(zhuǎn)移+包裝+包膜+輔助）轉(zhuǎn)染293T細胞，48-72小時收集上清 | 質(zhì)粒純度＞1.8（A260/A280），無內(nèi)毒素 |
| 病毒濃縮 | 超速離心（50,000×g）或PEG沉淀法，提高滴度10-100倍 | 濃縮后滴度＞1×10? IFU/mL |
| 滴度測定 | 流式細胞術(shù)（熒光報告基因）或qPCR（病毒基因組拷貝數(shù)） | 功能性滴度（TU/mL）＞10?為合格 |
（二）靶細胞轉(zhuǎn)染與篩選
感染條件優(yōu)化：
添加聚凝胺（Polybrene，8μg/mL）增強病毒吸附 。
感染復(fù)數(shù)（MOI）測試：通常MOI=5-20（根據(jù)細胞類型調(diào)整） 。
穩(wěn)定株篩選：
抗生素篩選：嘌呤霉素（1μg/mL）處理7-14天，清除未轉(zhuǎn)染細胞 。
單克隆擴增：有限稀釋法獲得均一性細胞株 。
關(guān)鍵技巧：
非分裂細胞（如神經(jīng)元）需延長感染時間至72小時 。
原代細胞建議使用低MOI（≤5）避免毒性 。
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