描述：

細胞發生凋亡時, 會激活一些DNA內切酶，這些內切酶會切斷核小體間的基因組 DNA，產生180bp-200bp的DNA片段，表現為瓊脂糖凝膠電泳中呈現的特異的梯狀Ladder圖譜。基因組 DNA 雙鏈或單鏈斷裂時會出現產生大量的粘性 3'- OH 末端，可在脫氧核糖核苷酸末端轉移酶(TdT)的催化作用下，與488/Cy-dUTP結合，從而通過熒光顯微鏡或流式細胞儀直接進行凋亡細胞的檢測，這類方法稱為脫氧核糖核苷酸末端轉移酶介導的缺口末端標記法（Terminal -deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling, TUNEL）。由于正常的或正在增殖的細胞幾乎沒有 DNA 的斷裂，因而沒有 3'-OH 形成，很少能夠被染色。Tunel 法可以對完整的單個凋亡細胞核或凋亡小體進行原位染色，能準確地反應細胞凋亡典型的生物化學和形態特征，可檢測出極少量的凋亡細胞，因而在細胞凋亡的研究中廣泛采用。 

本試劑盒應用范圍廣，可用于檢測冷凍或石蠟切片中的細胞凋亡情況，也可檢測培養的貼壁細胞或懸浮細胞的凋亡情況。可選擇性的檢測凋亡細胞，而非壞死細胞或因輻照和藥物治療而造成的 DNA 鏈斷裂的細胞。本試劑盒檢測細胞凋亡，耗時短，只需一步染色反應，洗滌后即可檢測。

使用方法：

一、實驗材料（自備）
 PBS緩沖液(1×,pH~7.4)、0.2% Triton X-100（PBS配制）、0.1%Triton X-100（PBS配制，其中含5mg/mL BSA）、4%多聚甲醛（PBS配制）、免疫組化筆、脫蠟溶劑（石蠟切片樣本）、石蠟切片處理相關試劑、抗熒光淬滅封片劑、ddH2O

二、實驗設計

A.陽性對照：
DNase I 處理制備陽性對照載玻片。DNase I 可以消化單鏈或雙鏈 DNA 產生單脫氧核苷酸或單鏈或雙鏈的寡脫氧核苷酸的核酸內切酶，人為造成細胞凋亡。
B.陰性對照：
使用不含 TdT Enzyme 的 TUNEL Reaction Buffer，用 ddH2O 替代 TdT Enzyme。
C.實驗處理組。
D.實驗對照組。

三、實驗步驟:

1、樣本準備：
（1）對于貼壁細胞或細胞涂片
     a. PBS 清洗 1 次。
     注：如果擔心細胞涂片的細胞貼得不牢，可以干燥樣品使細胞貼得更牢。
     b. 固定：加入適量 4%多聚甲醛（PBS 配制），4°C固定 30 min。PBS 清洗 2 次。
     c. 通透：加入適量 0.2% Triton X-100（PBS 配制），室溫通透 20 min。PBS 清洗 2 次。
     d.轉步驟 2. TUNEL 反應。

（2）對于懸浮細胞或細胞懸液
     a. 收集細胞（3-5×106個細胞），1000 rpm 離心 5 min，PBS 清洗 2 次。
     b. 固定：加入適量 4%多聚甲醛（PBS 配制）充分重懸細胞，4℃固定 30 min。2000 rpm 離心 5 min，PBS 清洗 2 次。
     c. 通透：加入適量 0.2% Triton X-100（PBS 配制），室溫通透 20 min。2000 rpm 離心 5 min，PBS 清洗 2 次。
     d. 轉步驟 2. TUNEL 反應。

（3）石蠟組織切片
     a.  脫蠟與水化：將切片樣本依次放入二甲苯 I（10 min）→ 二甲苯 II（10 min）→ 100％乙醇 I（5 min）→ 100％乙醇 II（5 min）→ 95%乙醇（5 min）→ 90%乙醇（5 min）→ 80%乙醇（5 min）→ 70%乙醇（5 min）→ ddH2O 沖洗 5 min，沖洗 2 次。
      注：二甲苯有毒，易揮發，請在通風櫥中進行此操作。
     b. 用濾紙吸干切片樣本周圍液體，用免疫組化筆圈好樣本輪廓，以便下游通透與標記。
     注：若在后續實驗操作中發現免疫組化筆畫的輪廓圈被破壞，需及時補畫。
     c. 通透：按 1: 100 的比例，將 2 mg/mL 的 Proteinase K 溶液用 PBS 稀釋至終濃度 20 µg/mL，在每個樣本上滴加 100 µL，使溶液覆蓋全部樣本區域，20-37℃孵育 20 min。
     注：Proteinase K 可通透細胞膜和核膜，從而使后續步驟的染色試劑充分進入細胞核進行反應，提高標記效率。孵育時間過長會增加組織切片在后續洗滌步驟中從載波片上脫落的風險，過短則可能造成透性處理不充分，影響標記效率。為得到更好的結果，Proteinase K 的濃度、孵育時間、溫度需根據不同類型組織樣本進行優化。
     d. PBS 漂洗切片 2 次，每次 5 min，用濾紙吸去多余的液體，將處理好的樣本放在濕盒中保持濕潤。
     注：這一步必須把 Proteinase K 洗滌干凈，否則會嚴重干擾后續的標記反應。
e. 轉步驟 2. TUNEL 反應。

（4）冰凍組織切片
     a. 固定：取出冰凍切片，并回溫至室溫。加入適量 4%多聚甲醛（PBS 配制），室溫固定 30 min。PBS 漂洗 2 次，每次 10 min。
     b. 用濾紙吸干切片樣本周圍液體，用免疫組化筆圈好樣本輪廓，以便下游通透與標記。
      注：若在后續實驗操作中發現免疫組化筆畫的輪廓圈被破壞，需及時補畫。
     c. 通透：按 1: 100 的比例，將 2 mg/mL 的 Proteinase K 溶液用 PBS 稀釋至終濃度 20 µg/mL，在每個樣本上滴加 100 µL，使溶液覆蓋全部樣本區域，20-37℃孵育 20 min。
      注：Proteinase K 可通透細胞膜和核膜，從而使后續步驟的染色試劑充分進入細胞核進行反應，提高標記效率。孵育時間過長會增加組織切片在后續洗滌步驟中從載波片上脫落的風險，過短則可能造成透性處理不充分，影響標記效率。為得到更好的結果，Proteinase K 的濃度、孵育時間、溫度需根據不同類型組織樣本進行優化。
      d. PBS 漂洗切片 2 次，每次 5 min，用濾紙吸去多余的液體，將處理好的樣本放在濕盒中保持濕潤。
       注：這一步必須把 Proteinase K 洗滌干凈，否則會嚴重干擾后續的標記反應。
       e. 轉步驟 2. TUNEL 反應。

（5）陽性處理（僅陽性對照進行此步驟，其他樣品直接進行 TUNEL 反應步驟）
       a. 按 1: 10 的比例用 ddH2O 將 10× DNase I Buffer 稀釋成 1× DNase I Buffer 備用。
       b. 滴加 100 µL 1×DNase I Buffer 到已處理的樣本上，覆蓋全部樣本區域，室溫平衡 5 min。
       c. 用 1×DNase I Buffer 以 1: 100 稀釋 DNase I (2 U/μL)至終濃度 20 U/mL 的工作液。
       d. 棄去 Buffer，加入 100 μL 濃度為 20 U/mL 的 DNase I 工作液，室溫孵育 10 min。
       e. 棄去 DNase I 工作液，PBS 清洗 2 次。
       f. 轉步驟 2. TUNEL 反應。

2、TUNEL 反應
（1）配制 TUNEL 反應液（即用即配）：

（2）對于貼壁細胞、細胞涂片或組織切片
      a. 每個樣本加入 50 μL TUNEL 反應液，使反應液均勻覆蓋樣本。37℃避光孵育適宜的時間（細胞推薦染色時間 30min-1h，組織染色時間推薦 2h）。
       注：50 μL TUNEL 反應液適合涂片、切片或 96 孔板（其他不同孔板可以適當調整 TUNEL 反應液體積，覆蓋細胞即可）。
      如果待檢測的樣品為涂片、切片或在 24 孔板、12 孔板或 6 孔板中，可以使用防蒸發膜，或自行嘗試使用自封袋或者其它適當材料自行裁剪成比孔略小的圓形塑料片，滴加 TUNEL 反應液后覆蓋在樣品上，可以防止 TUNEL 反應液蒸發，并且使TUNEL 反應液均勻覆蓋樣本。
     b. 棄去 TUNEL 反應液，PBS 漂洗 2 次，再用 0.1% Triton X-100（PBS 配制，其中含 5 mg/mL BSA）漂洗 3 次，每次 5 min，這樣游離的未反應的標記物可以清除較干凈。
     c.（可選）每個樣本加入適量濃度為 5 μg/mL 的 DAPI 染液，室溫避光孵育 5 min。染色完成后，棄去 DAPI 染液，PBS 漂洗 2 次，每次 5 min。
     d.（可選）切片封片：每個樣本滴加 50 μL 抗熒光淬滅封片劑（抗熒光淬滅封片劑可能會不適用于某些染料，實驗前建議進行預實驗測試匹配性），蓋上蓋玻片，用鑷子的鈍端輕輕敲擊蓋玻片，去除氣泡以使封片。       
     e.  用濾紙吸去多余的液體，向樣本區域加 100 μL PBS 保持樣本濕潤，立即在熒光顯微鏡下觀察。

（3）對于懸浮細胞或細胞懸液
       a. 每個樣本管加入 50 μL TUNEL 反應液輕輕重懸細胞，37℃避光孵育 30~60 min。每隔 15 min 用微量移液器輕輕重懸細胞。
       b.  2000 rpm 離心 5 min，棄去 TUNEL 反應液，加入適量 0.1% Triton X-100（PBS 配制，其中含 5 mg/mL BSA）輕輕重懸細胞，并清洗 2 次，每次5min，這樣游離的未反應的標記物可以清楚較干凈。
      c. 每個樣本管加入 100 μL 濃度為 5 μg/mL 的 DAPI 染液，室溫避光孵育 5 min。
      d. 加入 400 μL PBS 重懸細胞，立即用流式細胞儀檢測或進行涂片后在熒光顯微鏡下觀察。

注意事項：

1、使用前請將產品瞬時離心至管底，再進行后續實驗。 
2、染色背景較重或非特異性著色明顯時可適當減少染色時間。 
3、實驗時建議增加陰性對照和陽性對照組。 
4、組分 A 使用時請佩戴口罩、手套，如接觸皮膚，請立即用大量水沖洗。 
5、熒光染料均存在淬滅問題，請盡量注意避光，以減緩熒光淬滅。 
6、為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

產品引用文獻：

Low-temperature photothermal-induced alkyl radical release facilitates dihydroartemisinin-triggered "valve-off" starvation therapy

Xiaomin Su, Boshu Ouyang, Yao Liu, Yang Wang, Ruizhe Xu, Lili Niu, NanNan Li, Ce Xu, Zanya Sun, Huishu Guo, Zhiqing Pang, Xiangrong Yu

Asian Journal of Pharmaceutical Sciences. 2023 Sep 30 .

影響因子： 10.2

Cold atmospheric plasma fumigation suppresses postharvest apple Botrytis cinerea by triggering intracellular reactive oxygen species and mitochondrial calcium

Jiankang Cao, Qiong Fang, Chenrui Han, Chongshan Zhong

INTERNATIONAL JOURNAL OF FOOD MICROBIOLOGY. 2023 Sep 11 .

影響因子： 5.4

Multimodal investigation reveals the neuroprotective mechanism of Angong Niuhuang pill for intracerebral hemorrhage: Converging bioinformatics, network pharmacology, and experimental validation

Jiawei Zhou, Tianlin Jiang, Jiahua Wang, Weilan Wu, Xiaochun Duan, Huiyun Jiang, Zhiyun Jiao, Xiaohong Wang

JOURNAL OF ETHNOPHARMACOLOGY. 2023 Aug 24 .

影響因子： 5.4