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化工儀器網>產品展廳>試劑標物>生化試劑>其它生化試劑>T5205-1000rxns T4 DNA Ligase (Fast)T4連接酶

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T5205-1000rxns T4 DNA Ligase (Fast)T4連接酶

參考價620.00
具體成交價以合同協議為準
產品標簽

內切酶

規格
1000U620.00元999 U可售

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北京蘭博利德商貿有限公司,成立于2007年。 專業從事生命科學方面的服務,為客戶提供試劑、耗材、儀器等產品,主要涵蓋生物化學、分子生物學、細胞生物學、微生物學、植物學、免疫學、免疫診斷、分子診斷等領域。


我公司有一支具有高度專業化的團隊,主要成員都來自于生物消耗品行業的的企業,有多年的從業經驗,可以為客戶提供標準化、專業化的服務。同時,生物行業的專家為我公司的發展提供戰略發展方面的資訊。


蘭博利德的企業使命 — 助力生物科研,促進生物科技發展!

 

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生命科學產品、生化試劑、實驗室耗材等

供貨周期 現貨 貨號 T5205

T4 DNA Ligase(Fast)





產品貨號:T5205-200U

儲存條件:-20

產品組成

組分

規格

T4 DNA Ligase(Fast)(5U/ul)

40ul

10×T4 DNA Ligase Buffer

1ml

50% PEG

1ml

注:1U=1 Weiss unit

產品簡

T4 DNA Ligase(Fast)由攜帶T4噬菌體gene30的大腸桿菌產生。該酶催化雙螺旋DNA或RNA之間的5'-磷酸基團和3'-羥基之間形成磷酸二酯鍵。該酶在雙鏈DNA、RNA或者DNA/RNA復合物間可修復單鏈缺刻并且可以連接有粘性末端或者平末端的DNA片段但對于單鏈核酸無活性,主要用于限制性內切酶酶切產物DNA片段克隆基因定點突變與PCR產物克隆、修復雙鏈DNA缺刻與線性DNA自環化。T4 DNA Ligase(Fast)需要ATP作為輔助因子,在室溫下完成粘性末端連接反應僅需10分鐘。

酶活單位定義

37℃條件下,1 Weiss unit的酶在20min內催化1nmol的[PPi]轉變為活性炭吸附態。1 Weiss unit等同于約200個粘性末端連接反應單位(CEU),相當于在16℃條件下,30min內連接50% HindIII消化后的λDNA片段。

酶活檢測條件

酶活在如下反應混合物中進行測試:66mM Tris-HCl(pH7.6),6.6mM MgCl,0.066mM ATP,10mM DTT,3.3μM[32PPi]。


質量控制

核酸量內控切酶制殘留測試

37℃條件下,將200U的T4 DNA Ligase(Fast)與1ug的pUC19DNA中溫育4h,未檢測出共價閉合環狀DNA轉變為帶有缺刻的DNA。

核酸外切酶殘留檢測

將酶液與雙鏈DNA底物在37℃溫育16h,通過DNA電泳檢測雙鏈DNA底物無變化。

藍白斑測試

室溫條件下,使用30U T4 DNA Ligase連接pUC57 DNA/HindIII,pUC57 DNA/PstI或pUC57 DNA/SmaI消化產物1h,然后用E.coli XL1-Blue感受態細胞轉化連接產物,檢測到少于1%的白斑。

使用方法

1.DNA插入片段連接至載體DNA(粘性末端連接)

1)于冰上配制如下反應體系:

試劑

使用量

線性化載體DNA

20~100ng

插入片段DNA

3:1~10:1(片段:載體摩爾比)

10×T4 DNA Ligase Buffer

2ul

T4 DNA Ligase(Fast)

1U(0.2ul)

Nuclease-FreeWater

To 20ul


2)充分混勻并瞬離,22℃溫育10min;

3)取1~5ul的連接產物用于50ul化學感受態細胞的轉化,或者取1~2ul用于50ul電轉感受態細胞的轉化。

注:如果連接反應產物用于電轉化,應使用離心柱或者氯仿抽提清潔DNA代替熱失活步驟。

2.DNA插入片段連接至載體DNA(平末端連接)

1)于冰上配制如下反應體系:

試劑

使用量

線性化載體DNA

20~100ng

插入片段DNA

3:1~10:1(片段:載體摩爾比)

10×T4 DNA Ligase Buffer

2ul

50% PEG

2ul

T4 DNA Ligase(Fast)

5U(1ul)

Nuclease-Free Water

To 20ul


2)充分混勻并瞬離,22℃溫育1h;

3)取1~5ul的連接產物用于50ul化學感受態細胞的轉化,或者取1~2ul用于50ul電轉感受態細胞的轉化。

注:如果連接反應產物用于電轉化,應使用離心柱或者氯仿抽提清潔DNA代替熱失活步驟

1. 線性DNA自環化

1)于冰上配制如下反應體系:

試劑

使用量

線性化DNA

10~50ng

10×T4 DNA Ligase Buffer

5ul

T4 DNA Ligase(Fast)

5U(1ul)

Nuclease-Free Water

To 50ul


2)徹di混勻并瞬離,22℃溫育10min;

3)取1~5ul的連接產物用于50ul化學感受態細胞的轉化,或者取1~2ul用于50ul電轉受態細胞的轉化。

注:如果連接反應產物用于電轉化,應使用離心柱或者氯仿抽提清潔DNA代替熱失活步驟。

2.接頭連接

雙鏈寡核苷酸接頭經常被用于在插入片段上產生粘性末端。接頭通常包含限制酶識別位點,在連接后經酶切處理產生和克隆載體匹配的粘端。有時候接頭已包含與克隆載體匹配的粘端,此時無需在接頭連接完成后進行插入片段的進一步處理。




1)于冰上配制如下反應體系:


試劑

使用量

線性化DNA

100~500ng

磷酸化接頭

1~2ug

10×T4 DNA Ligase Buffer

2ul

50% PEG

2ul

T4 DNA Ligase(Fast)

2U(0.4ul)

Nuclease-Free Water

To 20ul


2)徹di混勻并瞬離,22℃溫育10min;

3)在65℃作用10min或者70℃作用5min,進行熱失活。

注:添加1mM ATP的條件下,T4 DNA Ligase(Fast)在LabFD™酶切緩沖液中具有100%活性。因此,接頭連接反應時可以在LabFD™酶切緩沖液中進行,以簡化“接頭連接-酶切”實驗流程。具體方法為:接頭連接反應完成后,先失活T4 DNA Ligase,然后向該體系中添加ATP至終濃度1mM,再在體系中加入適量的LabFD™快速內切酶,最后使用最適酶切反應溫度進行溫育即可。

注意事項

1)T4 DNA Ligase在濃度高于200mM的NaClKCl中會被強烈抑制;

2)連接反應液添加量不應該超過感受態細胞體積的10%,不推薦體系中加入過量的T4 DNA Ligase;

3)與T4 DNA Ligase結合的DNA可能會在瓊脂糖凝膠中出現帶移或彌散,為了避免此現象,可以在上樣前對酶進行熱失活,必要時加入適量的SDS;

4)聚乙二醇(PEG)能極大地提高平末端連接的連接效率,PEG8000的推薦添加量是連接體系的5%(w/v);

5)電轉化效率可能通過對T4 DNA Ligase熱失活或者使用離心柱或者氯仿抽提純化DNA方式來提高;

6)轉化子數目可通過延長反應時間至1h而增加。






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